猪软骨细胞老化过程中Aggrecan的表达及其糖链分子结构的改变

本实验旨在探讨体外培养软骨细胞在老化过程中,aggrecan的表达水平与分子结构的变化及其间的相互关系.取体外培养P1～P5各代猪耳软骨细胞,RT-PCR检测aggrecan球间区域(interglobular domain, IGD)mRNA的表达状况;阿利新兰(Alcian Blue)法检测糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量和糖链的分子结构.结果显示aggrecan IGD mRNA的表达在P4、P5细胞内明显降低(P＜0.05);GAG的合成也在P4、P5时显著减少(P＜0.05),但这2项指标的变化趋势之间无显著相关性.而长链/高度硫酸化的GAG由P4软骨细胞开始,绝对含量和相对含量均显著减少(P＜0.01),其与aggrecan IGD mRNA的变化趋势有显著相关性(P＜0.01) .由此可见,体外培养软骨细胞中aggrecan的表达合成和细胞老化有密切关系.aggrecan IGD mRNA的表达降低与aggrecan中长链/高度硫酸化GAG的合成代谢过程受阻可能是影响老化细胞成软骨能力的重要因素之一.

谷氨酸钠对新生豚鼠耳蜗螺旋神经节的毒性损伤

探讨谷氨酸钠不同给药时程及不同存活时程对新生豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞及听力损伤的程度.谷氨酸钠按2g/kg腹腔注射给予,每天一次.G21-0组:连续用药21d;G7-14组:连续用药7d,停药后饲养14d;G7-35组:用药7d,后饲养35d.随后检测其听力水平以及螺旋神经节细胞的形态变化.结果表明各组听阈均有升高,伴有神经节细胞的部分消失,G21-0组听阈为:65.3±21.5dB,神经节细胞密度为:1985.3±1021.7/mm2;G7-14组:听阈63.8±19.2dB,细胞密度3145.4±1225.3/mm2;G7-35组:听阈54.6±14.3dB,细胞密度2990.4±1022.1/mm2.提示谷氨酸钠对新生豚鼠螺旋神经节细胞毒性损伤程度与用药时程有关;受损细胞大部死亡,部分细胞随再存活时间逐渐自我修复;听力恢复与停药后存活时间及节细胞状态关联.

己酮可可碱和PGE1缓解大鼠腹主动脉缺血/再灌注损伤

为探讨己酮可可碱(PTX)和前列腺素E1脂微球载体试剂(LipoPGE1)对腹主动脉缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用,对大鼠行腹主动脉I/R,在阻断前、术中再灌注1h、再灌注48h采集假手术组、I/R组、PTX治疗组、LipoPGE1治疗组、PTX和LipoPGE1联合治疗组静脉血,采用酶联免疫实验方法测定肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素IL-1β、IL-8的含量.应用SAS8.1对实验数据进行双因素方差分析,两两比较用SNK-q检验.结果显示PTX治疗组、LipoPGE1治疗组、联合治疗组可显著降低血浆TNF-α、IL-1β、IL-8的含量,联合治疗组和PTX治疗组、LipoPGE1治疗组相比有显著性差异.提示PTX和LipoPGE1可降低促炎细胞因子,而联用PTX和LipoPGE1可取得更好的效果,减轻机体的炎症反应.

新型阿片受体配基特异性结合μ受体并抑制cAMP生成

本文研究新合成阿片受体配基对稳定表达μ阿片受体的CHO细胞的受体结合特性和对胞内cAMP的抑制作用.采用放射性配基结合的方法研究了阿片受体配基[3H]-diprenorphine(3H-dip) 在稳定表达μ阿片受体的CHO细胞模型上,对μ阿片受体的饱和性结合特征及和一系列新合成阿片配基A、B、C、D、E、F、G、及 DAMGO([D-Ala,N-Me-Phe4,Gly-ol5]-enkephalin)和吗啡的竞争性结合特征.利用竞争性结合蛋白法测定阿片受体配基对胞内cAMP的抑制作用.[3H]-diprenorphine 结合μ阿片受体的Kd值为1.06nmol/L; Bmax 为930 fmol/mg 蛋白.结果表明新配基、DAMGO和吗啡竞争性结合μ受体的IC50值分别为13.33 ±3.73、14.36 ±1.58、 0.62 ±0.03、56.38±2.33、 65.72±26.44、33.10±11.33、0.55±0.06、3.69±1.59 和1.83±0.50.其中C和G配基对μ阿片受体的亲和力高于DAMGO和吗啡.B、D、E和F配基对μ受体的亲和力低于DAMGO和吗啡.新配基、DAMGO和吗啡抑制cAMP生成的IC50值分别为6.49 ±1.59、1390 ±61.10、0.84 ±0.11、2.33±1.24、25.00±17.20、1.42±1.21、0.01±0.01、0.10±0.05和0.04±0.01.其中G配基的抑制胞内cAMP作用强, 强于吗啡,类似DAMGO.A、C、D和F配基作用类似DAMGO和Morphine.初步结果表明新配基C和G对μ亚型的阿片受体有良好的亲和力. G配基抑制胞内cAMP作用强.

肿瘤坏死因子α/淋巴毒素α基因多态性与支气管哮喘的关系

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)在哮喘炎症过程中起重要作用,本文探讨了TNFα/LTα基因多态性和哮喘遗传易感性及相关表型的关系.采用聚合酶链反应(PCR)-限制性长度多态性(RFLP)检测TNFα/LTα基因多态性在125名哮喘个体,12个哮喘家系成员和96名无血缘关系的健康对照者间的分布;并测定了哮喘患者血清的TIgE;肺通气功能,支气管舒张试验,乙酰甲胆碱(Mch)气道激发试验.TNFα*2/2基因型的频率在哮喘组较健康对照组明显增高(20.8% vs 11.4%,P＜0.05),优势比(OR)为2.259 (95%CI1.301～4.949);等位基因频率TNF2在哮喘组较健康对照组明显增高(0.42 vs 0.33,P＜0.01).LTα基因的频率在两组间分布无差异.Logistic回归分析显示:TNFα*2/2基因是哮喘的独立危险因素(P＜0.05),OR值为0.226 (95% CI 0.055-0.9251).携带TNFα*2/2基因型的患者在吸入β2激动剂20分钟后,FEV1的改善较携带其它基因型的患者差(24.09±19.5)% vs [29.46±22.60)% vs (38.81±31.53)%,P＜0.05].家系分析显示:TNFα基因/LTα基因与哮喘连锁关系不肯定,LOD值＜1.TNFα*2/2基因型与哮喘的易感性相关,并调节了气道的可逆性.

耐甲氧青霉素金黄色葡萄球菌与敏感菌株侵袭宿主细胞过程之比较

通过研究MRSA与MSSA对宿主细胞的侵袭和侵袭后过程,对两株金黄色葡萄球菌的粘附能力、内在化能力、引起[Ca2+]i 变化的能力和诱导细胞凋亡的能力进行比较.结果显示两株金黄色葡萄球菌粘附和内在化进入宿主细胞的菌数,引起[Ca2+]i 变化的峰值和动力学曲线以及诱导细胞发生凋亡的程度都基本相似.从而提示两株金黄色葡萄球菌侵袭宿主细胞的机制基本一致,而不同的宿主细胞对金黄色葡萄球菌侵袭的反应不相同.

细胞周期蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及活性测定

近来发现了一个新的A型细胞周期素基因A1(cyclin A1),在人源白血病细胞系及一些肿瘤细胞系中高表达,推测它的过量表达可能与肿瘤的发生相关.将cyclin A1和cdk2的基因插入到杆状病毒中,在sf 9昆虫细胞中进行了表达.蛋白印迹试验结果表明,这两种基因可以在该系统中稳定地表达;对B-myb蛋白的磷酸化和脱磷酸化试验表明,杆状病毒表达系统表达的这两种基因的产物具有生物活性.

血脂康抑制猪肝HMG-CoA还原酶的活力

为了从酶学实验证实血脂康是羟甲基戊二酸单酰CoA(HMG-CoA)还原酶的抑制剂,用多次冻融、超离心、硫酸铵分步沉淀及热处理纯化了猪肝HMG-CoA还原酶并用分光光度法测其酶活力和反应速度.从500g新鲜猪肝组织得到116mg HMG-CoA还原酶粗制品, 含10.4活力单位,比活力为89mU/mg蛋白.按米氏方程双倒数作图法求得其对底物HMG-CoA的米氏常数即Km为74.4μmol/L,其纯度及活力均达到动力学实验要求.利用该酶制品比较了国产降血脂药血脂康与进口降血脂药洛伐他汀及辛伐他汀对HMG-CoA还原酶的抑制动力学性质.实验结果显示,血脂康与洛伐他汀、辛伐他汀均为HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂;抑制作用强弱为血脂康＞辛伐他汀＞洛伐他汀;其抑制常数Ki分别为19.9μg/mL、24.8μg/mL 和41.6μg/mL.以上表明,血脂康对猪肝HMG-CoA还原酶有抑制作用,为血脂康降脂疗效提供了科学的实验依据.

雌激素刺激活动性狼疮肾炎外周血单个核细胞的IL-10表达

探讨性激素对活动性狼疮肾炎外周血单个核细胞(PBMC)Th2细胞活化的影响.采用ELISA、RT-PCR等方法检测了雌激素对19例活动性狼疮肾炎和16例健康人外周血单个核细胞(PBMC)IL-10表达的调节作用.活动期狼疮肾炎PBMC IL-10mRNA 和蛋白含量明显高于正常人(P＜0.05);与正常对照相比,雌激素明显提高了活动性狼疮肾炎PBMC IL-10蛋白和mRNA水平(P＜0.05),雄激素的加入明显抑制了雌激素诱导的活动性狼疮肾炎PBMC IL-10蛋白和mRNA水平(P＜0.05).雌激素、雄激素比例失调可能参与了活动性狼疮肾炎IL-10的高效表达.

内源性一氧化碳对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的影响

探讨内源性一氧化碳(CO)对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的作用及其机制.采用常压低氧大鼠肺动脉高压模型,观察血红素加氧酶(HO)抑制剂锌原卟啉-9(ZnPP-9)对肺动脉平均压(PAMP)和肺组织匀浆碳氧血红蛋白(HbCO)含量的影响, 并用免疫组织化学和核酸原位杂交法分别观察Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达和肺动脉Ⅲ型前胶原[Proα1(Ⅲ) 胶原]mRNA、间质性胶原酶(MMP-1)mRNA、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP) mRNA表达的变化.结果发现ZnPP-9使低氧大鼠PAMP明显升高,肺组织匀浆CO含量明显降低;ZnPP-9显著促进低氧大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达(P＜0.01) 和Proα1(Ⅲ) 胶原mRNA表达及MMP-1mRNA与TIMP-1mRNA表达(P＜0.01).内源性CO可能通过抑制胶原蛋白的合成对低氧大鼠肺动脉胶原代谢发挥重要的调节作用.

计算机辅助设计提高人NMDA受体主亚基M3-M4环在E.coli中的表达

基于对螺旋区随机堆积的RNA二级结构的预测和密码子偏性计算, 建立了pBV220载体中外源基因高效表达的判别模型.该模型认为,外源基因的表达水平与其5′端-30～39区域,以及3′端30～-39区域的RNA二级结构自由能具有显著的统计学意义;其次与3′端9 bp的局部密码子偏性相关.据此模型,使用RNAfold和Goldkey软件优化改构设计了用于克隆表达人NMDA受体主亚基M3-M4环的引物.将PCR扩增的基因克隆入pBV220载体中,在大肠杆菌DH5α宿主中获得了高效表达(表达水平在20%以上).

卵巢切除对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化形成的影响

为探讨卵巢切除对CCl4诱导大鼠肝纤维化形成的影响,采用CCl4诱导雌性大鼠肝纤维化动物模型,观察卵巢切除及雌激素替代治疗(苯甲酸雌二醇1mg/kg)对肝脏胶原沉积和I、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响,并分别检测血清学标志及肝脏组织学等变化. 结果显示CCl4模型组大鼠肝脏发生典型的肝纤维化改变,卵巢切除组的肝脏胶原沉积更为明显,肝脏表达I、Ⅲ型胶原及血清肝纤维化指标也明显高于CCl4摸型组(P＜0.05),而雌激素干预及替代治疗则可抑制肝纤维化的形成.表明卵巢切除加速CCl4诱导大鼠肝纤维化的形成,其发生可能与卵巢分泌的雌激素对肝纤维化的抑制作用有关.

牛磺酸对失血性休克复苏家兔肺组织NOS活性及NO含量的影响

探讨失血性休克复苏时肺组织中一氧化氮合酶(NOS)活性、一氧化氮(NO)含量的变化及牛磺酸对其的影响.新西兰种兔24只随机分为三组(n=8):对照组、休克复苏组、牛磺酸治疗组.采用失血性休克复苏动物模型.结果发现:休克复苏3h肺湿重/肺干重、肺水含量、肺通透指数(LPI)、肺泡灌洗液(PALF)中蛋白含量、肺组织中NOS活性、NO含量均升高(均P＜0.01).同时,血浆中NOS、LDH活性及NO含量均有显著升高(均P＜0.01).预先给予牛磺酸(静脉注射,40mg/kg体重)可显著缓解上述变化(均P＜0.01).提示失血性休克复苏时NOS的激活和NO的大量释放,对休克复苏所致肺损伤的发生发展起重要作用,牛磺酸对这种肺损伤具有明显的保护作用.

不明原因不孕症患者子宫内膜印迹基因H19表达异常

探讨H19基因表达变化在不孕症发病中的作用.应用PCR、RT-PCR以及RsaI酶切位点多态性观察H19特殊等位基因表达,检测不明原因不孕症子宫内膜中的印迹状态.结果显示,25例正常窗口期杂合子子宫内膜中H19皆表达单等位基因,而38例不明原因不孕症患者窗口期子宫内膜中杂合子全部表达双等位基因,提示H19印迹丢失可能与不明原因不孕症的发病有关.这为临床诊断和治疗不明原因不孕症提供了新思路.

支气管哮喘大鼠γδT细胞分布和凋亡的变化

探讨γδT细胞在支气管哮喘外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的分布和凋亡状态.应用鸡卵清蛋白(OVA)致敏和刺激Wistar大鼠(每组10只),制作致敏大鼠哮喘模型,收集外周血单个核细胞(PBMC)和BALF,采用流式细胞术检测γδTCR+ T细胞百分率和CD28/γδTCR平均荧光密度比,并用免疫荧光法结合HE染色以及免疫组化法检测γδT细胞占淋巴细胞的百分率,用TENUL法检测淋巴细胞凋亡.哮喘组PBMC中γδT细胞占总T细胞或总淋巴细胞比例明显低于正常组(P＜0.05),CD28/γδTCR平均荧光密度比则无明显差别;BALF中γδT细胞占总T细胞或总淋巴细胞比例明显高于正常组(P＜0.01), CD28/γδTCR平均荧光密度比也有显著增加(P＜0.01);哮喘组PBMC和BALF中淋巴细胞凋亡指数明显低于正常对照组(P＜0.01).提示γδT细胞亚群参与了哮喘的发病过程.

TWEAK及IFN-γ在诱导表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞凋亡中的协同作用

以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞为细胞模型,研究新型凋亡分子TWEAK对HBV感染细胞的作用机制. MTT法检测TWEAK和IFN-γ对HepG2.2.15 细胞的杀伤效应.流式细胞术(FCM)分析TWEAK和IFN-γ作用后,HepG2.2.15细胞的凋亡率及细胞周期变化.HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒测定TWEAK与IFN-γ作用24小时后,HBV病毒颗粒的分泌表达状况.TWEAK对于HepG2.2.15细胞有较弱的杀伤效应和诱导凋亡效应,但是与IFN-γ联合作用后,HepG2.2.15细胞的凋亡率显著上调, 细胞周期阻滞在G0/G1期,并且TWEAK与IFN-γ能够协同抑制HepG2.2.15细胞病毒颗粒的分泌.TWEAK在IFN-γ的参与下,可以诱导HBV相关的HepG2.2.15细胞发生较强烈的凋亡反应,这提示,在HBV感染者体内的炎症反应环境中,TWEAK极有可能通过与炎性因子的协同效应参与对病毒感染细胞的杀伤效应.

急性坏死性胰腺炎模型大鼠肠血流量及血清磷脂酶A2、白介素-1β的变化

观察了急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)时肠组织血流量及炎症介质的变化.实验用96只SD大鼠,随机分成对照组和ANP组,以5%牛磺胆酸钠胰腺被膜下均匀注射复制ANP模型.采用放射生物微球技术在制模后0h、2h和12h分别测定肠组织血流量,同时检测血清磷脂酶A2(PLA2)活性及白细胞介素-1β(IL-1β)水平,并观察肠粘膜病理改变.结果显示,ANP组在制模后2h及12h肠组织血流量(0.80±0.07,0.50±0.06)mL/(min*g)较对照组(1.56±0.18,1.61±0.11)mL/(min*g)明显减少(均P＜0.001),血清PLA2活性(94.29±9.96,103.71±14.40)U/L,IL-1β水平(0.78±0.13,0.83±0.20)μg/L较对照组(65.27±10.52,66.63±9.81)U/L,(0.32±0.06,0.33±0.07)μg/L明显升高(均P＜0.001),肠粘膜损伤程度较对照组明显加重(均P＜0.001).提示ANP早期肠组织血流量减少与炎症介质的升高同时发生,两者均是ANP时肠粘膜损伤的重要因素.

人内皮型一氧化氮合酶cDNA在COS-7细胞中的表达

本研究从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法,扩增出人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA,总长度为3731bp.将其克隆入pUCm-T载体质粒,序列分析表明,克隆所得片段含有完整开放阅读框架,与GenBank中heNOS cDNA序列同源性达99.93%,在此基础上发现有若干核酸多态性.将该基因片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,用脂质体转染法将pcDNA3.0/heNOS转染到COS-7细胞株,RT-PCR、Western blot分别检测到外源性eNOS基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达,分析表明所表达的heNOS蛋白质分子量为145ku;L-14C-精氨酸掺入同位素法检测证实所表达的eNOS蛋白具有生物学活性,能将精氨酸氧化为瓜氨酸.

波比宁对鼠的镇痛及抗炎作用

寻找无成瘾而又具有镇痛作用的化合物受到普遍关注,据国外有关报道,一种富马酸异哌丙吡胺(波比宁 Probne)化合物在临床上具有强的镇痛作用,并且起效迅速,而无成瘾性,与同类镇痛药相比,副作用小,具有独特的疗效[1].目前国内已有生产,但波比宁的镇痛及抗炎作用,国内未见报道.为此本文观察波比宁对鼠的镇痛及抗炎作用.

肝癌组织浸液尿激酶型和组织型纤溶酶原激活物的检测

一些研究表明体液中的尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase type plasminogen activator,u-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uokinase type plasminogen activator receptor,u-PAR )浓度与癌细胞自身分泌和释放的水平及其浸润转移有关,而组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PA)则与癌组织血管内皮细胞的释放和血管新生有关,组织型纤溶酶原激活物抑制剂(Tissue plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)则对t-PA和u-PA起调控作用,同时参与癌细胞的转移等过程[1,2].

P物质参与大鼠外侧网状核痛觉调制的可能机制

延髓腹侧尾端的外侧网状核(LRN)在痛觉的下行抑制过程中起重要作用,并参与了电刺激中脑导水管周围灰质(PAG)的镇痛过程.P物质(SP)是与痛觉调制有关的速激肽.微量SP注入中脑导水管周围灰质、背缝核可产生镇痛效应.但有关SP在LRN中参与痛觉调制的作用, 尚未见报道. 本文采用核团内微量注射方法,以甩尾反射潜伏期(TFL)为痛阈指标,对SP在大鼠LRN中参与痛觉调制的作用及其可能机制进行了探讨.

水通道蛋白4在大鼠胃内的分布

水通道蛋白1(Aquaporin 1,AQP1)首次被克隆[1]并证实其对水分子具有高度选择性和通透性,这为解析水分子快速透过以脂质双层分子为骨架基础,并具有亲脂性的细胞膜提供了结构基础.

基因治疗会导致癌症吗?

第三讲 临床研究的实验室工作

有些临床医师,特别是资深医师,有时强调临床工作是经验性科学,往往把某些个别的情况作为普遍性的规律来考虑.这里就涉及到一个基本的科学原理,那就是说数量上达到一定程度的研究才有可能发现与科学的联系,个别的现象不能作为真理来对待.因而有必要进行一些临床科研工作的探讨.

对接触系统的再认识

目前人们已认识到接触系统在启动体内凝血方面所起的作用微乎其微,而接触系统蛋白的缺乏却可能是血栓形成的危险因素.研究表明活化的因子Ⅻ (FⅫa) 和活化的因子Ⅺ (FⅪa) 可裂解纤溶酶原;激肽释放酶能将前尿激酶活化为双链结构的尿激酶;高分子量激肽原和低分子量激肽原能选择性抑制凝血酶诱导的血小板活化;高分子量激肽原可通过置换粘附蛋白抑制细胞粘附,可通过抑制内皮细胞的迁移和增殖抑制血管新生;内毒素可激活接触系统,高分子量激肽原的下降和α2巨球蛋白-激肽释放酶复合物的上升与不可逆低血压的发生显著相关.总之,接触系统在促进纤维蛋白溶解、抗血栓、抗粘附、抑制新生血管形成、介导炎症反应等病理生理方面起着重要作用.

血管内皮生长因子的生物学及其在临床的初步应用

血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异性的有丝分裂原.它诱导内皮细胞增殖、促进内皮细胞迁移,并抑制内皮细胞凋亡,在调节血管和淋巴管新生中起重要作用.VEGF也是胚胎发育、软骨内骨形成、女性生殖系统、以及肿瘤和眼球内血管新生所必需的.另外,VEGF也可诱导血小板粘附于血管内皮细胞而出现高凝状态.目前,有许多临床实验正在评价VEGF在血管新生依赖性疾病的促血管新生作用和抗血管新生药物用于治疗的效果.

内毒素对内皮细胞促凝及抗凝功能的影响

革兰阴性杆菌所致重症感染常引起弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭.其主要病理生理机制之一是内毒素直接或间接作用于内皮细胞,受损的内皮细胞释放多种促凝因子、趋化因子、调节因子、粘附因子和血小板活化因子等.在促进炎症反应、启动补体系统的同时,进一步加剧凝血系统的活化;天然抗凝系统,包括抗凝血酶、蛋白C和组织因子途径抑制物,则受到不同程度的抑制;纤溶系统虽然在一定程度上被活化,但不能抵御内毒素血症时促凝和抗凝系统的失衡,其结果促进了高凝状态的发生.

凝血酶激活的纤溶抑制物: 新的凝血纤溶调控因子

凝血酶激活的纤溶抑制物(Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,简称TAFI),作为凝血及纤溶调控因子,是近十年来国外医学界研究的热点之一; TAFI的基础研究是对经典凝血及纤溶调控机制的重要补充;在体内主要由凝血酶、凝血酶调节蛋白、纤溶酶、肝素、胰蛋白酶等物质激活而导致纤溶机制受抑,血栓溶解时间延长,从而增加血栓形成的危险性.TAFI在体内还参与缓激肽、补体等活性物质的调节.动物血栓模型运用TAFI拮抗剂与溶栓剂联合治疗,取得良好效果.国外医学界对TAFI与血液、心血管、内分泌等系统疾病的发病关系已展开广泛研究.