小檗碱在溃疡性结肠炎中作用及机制的研究进展

　　小檗碱在溃疡性结肠炎中作用及机制的研究进展

　　张苏王志斌王跃仝令畅王荣美李玲张立超

　　摘要：溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，其发病机制可能与遗传、环境、免疫及微 生物有关。小檗碱是黄连的主要成分，临床上主要用于抗炎。近年来研究发现小檗碱对UC有良好的疗效， 但治疗机制尚不完全清楚，可能通过调整肠道菌群结构、保护肠道屏障功能、调节免疫应答反应、影响氧化 应激等来发挥治疗作用，该文就此作一综述，为小檗碱应用于UC治疗提供理论依据。

　　关键词：溃疡性结肠炎;小檗碱;紧密连接;免疫调节;氧化应激 IX)!： 10. 3969/j. issn. 1673-534X. 2016. 03. 002

　　溃疡性结肠炎(UC')是一种慢件非特异性肠道炎 性疾病，其病程漫长，常反复发作、迁延不愈，ti氏期的 UC易发生癌变。近年来UC的发病率呈上升趋势，且 趋于年轻化，以20～25岁患者居多。[」前认为UC的 发病吋能与遗传、环境、免疫和微生物有关，frl其确切 机制并不清楚。临床上对UC的治疗以氨基水杨酸类 药物、肾1:腺糖皮质激素类药物及免疫抑制剂为主，但 都存在一定的不良反应，如胃肠道不适、过敏反应等。

　　小檗碱乂称黄连素，是从黄连、黄柏、三颗针等植 物中提取;li的一种异哞啉类生物诚，具有抗炎、抗蘭等 药理作用。许多临床研究和动物实验研究证实，小檗 碱对UC有良好的疗效，其町能通过调整肠道菌群结 构、保护肠道屏障功能、调传免疫应答反应、影响氧化 应激等来发挥作用。本文就小檗碱治疗UC的上述4 个方面的作用机制作一综述。

　　1调整肠道菌群

　　小檗碱的生物利用度较低.经肠壁吸收差，使 得其在被肠k皮细胞吸收之前吋以在肠道中发挥 药理作用。双歧杆菌具有保护肠黏膜、改善肠壁通 透性的作丨j丨。)U小檗碱(1(1 mg/kg和2() mg/kg)治 疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠后，用 BL琼脂板培养小鼠的新鲜粪便，发现小檗碱治疗 绀的双歧杆阑数较对照组敁箸增加(P<〇. ()5)， 症状得到改善，且具有剂量依赖性，这表明小檗碱 吋通过恢复双歧杆菌的数縫来保护肠道屏障W。

　　此外，小檗碱nj•通过影响肠道菌群的组成结构来调节结肠炎。双歧杆菌、产乙酸细菌(

　　属)、支原体(属)等可产生短链脂肪酸 (SCFA)，结肠黏膜能量来源的6(>%～70%为 SCFA(主要为乙酸和丁酸)，肝脏能量的主要来源 为脂肪酸氧化，而SCFA可不需载体直接进入线粒 体，参与氧化供能。给予TNBS诱导的Wistar大鼠 小樂碱(1()〇 mg/kg) U服，连续给药18周后，发现 小檗碱n]•硓著升高粪便中的SCFA浓度，特别是乙 酸和内酸，这表明门服小檗碱能选择性地富集产 SCFA的菌群，促进结肠内发酵，增加肠道中SCFA 的产量，从而保护肠道屏障[2]。

　　2保护肠道屏障功能 2.1保护紧密连接

　　UC是一种肠黏膜炎性疾病，其发病和黏膜修 复都勾肠道屏障功能紧密相关。紧密连接(TJ)是 构成肠[•.皮机械屏障功能M主要的结构,'n的开放 主要依赖于TJ蛋白的表达和分布，如咬合蛋白 (occludin)、紧密连接蛋白-1 ( Z(M )和闭合蛋白 (daudin)等[3 4]。UC患者伴有TJ蛋白分布的改 变。C57BL/6小鼠饮用含3%葡聚搪硫酸钠(DSS) 的水4 d，给予小檗喊(100 mg/kg)灌胃处理3 d，取 结肠组织免疫染色后发现，小檗碱阻止了 I)SS诱导 的Z(V1从TJ复合体顶端向结肠h皮细胞的细胞 质隔室的重分布[5]。

　　酪氨酸激酶Src(Tyr416)信&通路影响claudin-1 的表达及其在TJ屮的分布，蛋白激酶B(PKB/Akt) 主要影响claudin-2的表达。claudin-1增多可降低大 分子的细胞通透件.claudin-2则口r诱导Na+、K+等阳 离?和水的细胞通道开放™。用5() 小檗碱

　　预处理HT-29/B6细胞10 min,再加入肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)(5(>U U/mU孵育15 min，免疫印迹结果 显示小檗碱可抑制TNF-a诱导的Akt(Ser473)、
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(Thr308)及Src (Tyr416)憐酸化作用，并可下调 claudin-2蛋白表达而上调claudin-1蛋白表达;激光共 聚焦敁微镜下可见，小檗碱uj•以逆转TNF-a引起的 claudin-1蛋白脱离TJ向顶端细胞质的重分布.表明 小檗碱通过抑制Src、Akt磷酸化，调节claudin-1的表 达和重分布及claudin-2的表达，从而发挥肠道屏障 保护作用[7]。

　　2. 2调节血小板聚集

　　血小板不仅具有止血和血栓形成的作用，还可 以通过释放炎性介质，扩大炎性反应。有研究发 现,UC患者静脉血中血栓素氏(丁乂&)水平高于正 常组，说明UC患者伴有血小板活化和高凝血状 态M。给予BALB/c小鼠饮用DSS以诱导Ur 模塑，给予小檗碱(4(> mg/kg和mg/kg}灌胃，结 果显示灌胃后第3天和第7天的血浆TXB2和 P-选择素水平均有显著降低(P<◦.⑴).这表明小 檗碱呈时间、剂量依赖性降低血浆TXB2和P-选择 素水平，从而改善DSS诱导的结肠炎小鼠血液的高 凝状态，减少血小板凝集[5’9]。

　　3调节免疫应答反应 3.1调节促炎细胞因子

　　小肠是分泌内源性TNF的主要器官。TNF-a 是UC结肠损伤中细胞因子连锁反应的关键性介 质™。用50 pmol/L小檗碱预处理HT-2()/B6细 胞 1() min 后，用 5()(> U/mL TNF-a 孵化 HT-29/B6 细胞30 min,可减弱TNF-a诱导的Akt-P(Ser473) 和Akt-P( Thr30«)的磷酸化，表明小檗碱通过抑制 PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化作用而减弱 TNF-a对肠道的损伤[7]。

　　干扰素-7(IFN-7)和TNF-a等细胞因子可通过 影响TJ的结构和功能来破坏肠道屏障功能["]。透 射电镜下■见，小檗碱(1〇〇 pm〇l/L)对IFN-7 (1()() U/mL)和 TNF-a(l() ng/mL)处理 Caco~2 细胞 后导致的细胞N XJ结构不完整、出现部分断裂有明 显抑制作用;Transwell实验结果M示，经小檗碱处理 后，异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FI>4)的流出速率 较对照组显著降低，表明小檗碱能抑制促炎细胞因子 造成的XI破坏，从而降低肠上皮细胞的通透

　　免疫系统功能紊乱及各类免疫细胞表达失衡 在UC发生发展中起重:要的作用。有#究发现 CD4+ T亚型Th1 /Thl7细胞分化调节控制的炎性 细胞因子IFN-7、白细胞介素<7(IL-17)表达失衡在 UC的发病中起作用。有研4用2. 5% TNBS诱导 BAI.B/c小鼠，给予小檗碱(100 mg/kg)治疗，吋降低结肠组织中IFN-7和1L17的水平，流式细胞术 发现小檗碱n丨降低脾脏中Thl细胞(分泌IFN-7)、 Thl7细胞(分泌1L-17)的细胞比例及p)4 + CD25 + Foxp3 + T细胞(Treg细胞)的数量，-'明小 檗碱可通过下调Thl和Thl7细胞亚群比例及抑制 Treg细胞的分化，进而降低炎性因子的水平，缓解 肠道炎性反应;此外，小檗碱可下调脾脏纯化得到 的CD4+ T细胞中信号转导与转录激活因子1 (STAT1)、STAT3的磷酸化，STAT信号通路是 Thl、Thl7细胞分化的重要通路，表明小檗碱通过 抑制STATK STAT3的磷酸化，进而抑制Thl、 Thl7细胞的分化，从而控制炎性反应M。

　　3. 2调节转录因子

　　核W子-KB(NF-«cB)的信号级联放大在炎性反 应应答中具有重要作用，其能促进促炎因子、趋化 闪子、诱导塑一氧化氮合酶(i N( )S)、环氧合酶' (C( )X-2)、黏附分子和炎性反应受体的表达。用 5(> "mol/L小檗碱预孵化HTD/B6细胞1() min， 吋抑制TNF-a诱导的NF-KB和IKBa磷酸化，其减 弱TNF-a的效应类似于NF-KB的特异性抑制剂 BAY1 卜7082(10 pmol/L)[17〕。用 5(> /xmol/M、檗 碱孵育 Jurkat 细胞 18 h，再用()• 1 nmol/L TNF-ct 孵育1() min,发现小檗碱BJ■以抑制NF-KB P65的磷 酸化、核移位及I/cBa降解，并可完全抑制kB激酶 (IKK)的激活[18]。5() pmol/L 小檗碱孵 f Jurkat 细胞h，再用5<)哗/mL蛋臼酶体抑制剂AI丄N 幡育 3() min，后用().1 nmol/L TNF-a 处理 1() min，免疫印迹分析胞质提取物发现小檗碱可以 明显抑制kBa磷酸化。这些结果表明小檗碱的抗 炎作用通过NF-kB信号通路抑制IKK的激活，导 致IKK稳定化，进而抑制kBa的降解，还nj■通过抑 制NF-kB和I»cBa的磷酸化从而抑制NF-kB 活化[1718]。

　　丝裂原活化蛋由激酶(MAPK)是信号从细胞 表面转导到细胞核内部的重要传递者，其可分为 4个亚族：细胞外信号调节激酶l/2(ERKl/2)、 p38、C-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋t4激 酶(SAPK)和ERK5。UC患#体内MAPK的激活 增加，内毒素(US)刺激的腹腔巨嚟细胞屮MAPK 的激活也增加。C57BL/6小鼠饮用含3% DSS的 水4 d后，用小檗碱(1()(> mg/kg)灌胃处理3 d，免疫 印迹结果城示小檗碱■抑制由DSS引起的结肠丨•. 皮细胞的KRKl/2、p38、JNK的磷酸化，表明小檗 碱通过抑制ERK1/2、P38、JNK的磷酸化从而抑制
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　　MAPK的激活•进而阻断信号传递。

　　3.3调节中性粒细胞

　　TNF-a能够刺激血管内皮细胞及中性粒细胞 (PMN)表达表面黏附分子.促进PMN聚集，利于 PMN释放活性氧(R()S)和蛋白水解酶等，从而加 重结肠的损伤程度。用30 g/L DSS诱导WLstar大 鼠7 d，再给予小檗碱(50 mg/kg)3 d,免疫组织化学 结果显示小檗碱HJ•下调I)SS引起的结肠组织细胞 间黏附分子(ICAM-1)的表达.并可减少结肠组织 中PMN的表达，说明小檗碱通过抑制PMN与内皮 细胞黏附分子的表达，进[fl丨减少炎性细胞浸润，减 轻炎性反应[awi]。

　　髓过氧化物酶(MP())主要由PMN、单核细胞 和某些组织的巨噬细胞分泌.外界刺激町导致PMN 聚集并释放MP()。C57BL/6小鼠饮用含3% DSS 的水4 d后，用小檗碱(100 mg/kg)灌胃处理3 d，与 对照组相比较，发现小檗碱叮显著抑制DSS诱导的 MPO活性及含量增加，表明小檗碱通过抑制MP() 的活性来改善UC的症状。

　　3.4调节内质网应激

　　内质网(ER)是哺乳动物细胞中一种重要的 亚细胞器，具有蛋^质修饰、加丄以及新生肽链 的折叠、组装和运输的重任。机体内外环境改 变，均可造成未折膂或错误折叠蛋卩丨质在ER内 蓄积，引发内质网应激(ERS)。持续而严重的 ERS，可触发ER相关性细胞凋亡，造成细胞损 伤。X-盒结合蛋白K XBP1)是ERS过程中重要 的信号通路，敲除小鼠肠h皮细胞中的XBP1基 因可引起肠道发生自发性炎性反应，其组织学改 变与人类UC相似，说明ERS在UC的发生发展 中起着重要的作川[n]。

　　GKP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP), 是一种ER分子伴侣蛋白，在维持KR蛋〇质合成、 iH确折膂和细胞钙稳态等方面起着t要的作〗IJ。 ERS时GRP78的表达h调。持续的ERS启动天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(caspaseH2)的凋 亡途径，造成细胞损伤。caspase~ 12活化后可以诱 导caspase~3表达升高，共同诱导细胞凋亡。用 20;miol/L小檗碱预处理Caco-2细胞2 h,再用 2. 5 ng/mL IFN-7 和 5() ng/mL TNF-a 解育 24 h， 结果敁示小檗碱吋M著降低GRP78的表达,降低剪 切形式的XBP1 mRNA水平以及抑制caspase~3升 高.这表明小檗碱能抑制ERS,达到减轻肠道炎性 反应和保护肠道的作用[23]。

　　4影响氧化应激

　　体内的高活性分子如R()S和活性氮(RNS)产 生过多，引起氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导 致组织损伤[24]。UC患者体内ROS和一氧化氮 (NO)明显增多，引起体内氧化、结肠组织和细胞损 伤，形成周而复始的连锁反应[25]。用30 g/L DSS 诱导Wistar大鼠7 d，再给予50 mg/kg小檗碱3 d, 免疫组织化学结果显示小檗碱可抑制结肠组织 iN()S的表达;此外小檗碱叶显著增加血清超氧化 物歧化酶(SOI))、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 的活性，并hJ•明显抑制丙二醛(MDA)、N()水平，这 表明小檗碱吋通过增强抗氧化系统、抑制氧化系统 来调节肠道内的氧化应激，减轻黏膜损伤[26_27]。

　　5结语

　　UC是目前胃肠道难治性疾病之一，易反复发 作，小檗碱主要通过调整肠道菌群结构、保护肠道 屏障功能、调节免疫应答反应及影响氧化应激等发 挥治疗UC的作用。然而，现有研究仍不能完全解 释小檗碱治疗UC的具体机制，需要吏多动物或临 床研究结果揭示其作用机制，为小檗碱应用于UC 提供理论依据。

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