但凡做一些与基因有关的实验，肯定离不了PCR，说到PCR，我们不得不提Primer——引物。很多同学会想，找公司设计啊，多简单!

　　我只能说：少年，你是不知道公司设计的引物有多随意，哼哧哼哧做了大半年，后才发现溶解曲线是双峰!

　　好了，话不多说，今天教大家如何利用PubMed简单地设计普通引物。

　　首先，打开PubMed，划到网页下端，找到Primer-BLAST，如图：

　　点开它出现一个小方框：

　　这个框框里需要放入目的基因的编码序列。这时候再次打开PubMed，将左侧选为Gene，我们以GAPDH为例，点击搜索：

　　此时会出现很多物种的GAPDH基因，我们选择Mus musculus (house mouse)，打开如下：

　　这个界面有很多关于该基因的信息，下次再详细讲述。将界面往下划，会出现该基因的mRNA和Protein，NM表示mRNA序列，NP表示氨基酸序列：

　　点击红框中的链接，会跳到mRNA的序列界面，此时，点击该网页中的CDS(蛋白质编码区)：

　　紧接着就会出现：

　　将被颜色标记的序列复制下来放入引物设计的框框中：

　　上图中红框右侧是自行选择扩增片段的大小，下方是每次出现的引物数目，再往下是引物的Tm值。关于片段大小，如果是做RT-PCR，一般100-200bp就足够了，如果是普通PCR，可以适当长一点，设置为300-400bp左右即可，这样可以避免同引物二聚体相混淆。Tm是解链温度，表示50%互补的核苷酸双链解链时所要达到的温度，通常选择60℃左右，与PCR程序中的退火温度相当，过高或过低均会引起扩增效率的改变。

　　如果不是特殊引物，我们只需要手动设置一下扩增产物的长度，其他的可以默认原始设置。一切就绪后，点击网页下方的Get Primers，耐心等待一下，就会出现很多条备选引物，如图：

　　上方是不同引物扩增片段所在的具体位置，下方的表格是这些引物的序列及相关信息。我们可以同时选取三对，经过PCR验证后，选择特异性佳的引物继续后续实验。

　　选取引物的基本原则如下：

　　1. 根据实验需要选择合适的产物长度。实时定量PCR：100-200bp，半定量PCR：300-400bp。

　　2. 引物序列碱基分布要随机，3’端不要选A，好选T，且不应超过3个连续的G或C。

　　3. 引物Tm值一般在60℃左右。

　　4. 引物GC含量在40-60%之间为佳，且上下游引物GC含量相差不要太大。

　　5. 上述表格后两列的数值代表引物互补的程度，数值越低，表明互补可能性越小，扩增效果越好。同时，上下游引物好数值接近。