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    p73基因作为p53基因家族的第一个成员,于1997年首先由KAGHAD等[1]发现。p73基因编码的P73蛋白,在结构和功能上均与P53蛋白具有很高的同源性[1,2],且与肿瘤的发生密切相关。因此,p73作为候选的抑癌基因,受到广泛关注。本文应用免疫组织化学方法对口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织中P53和P73蛋白表达进行检测,探讨其在口腔鳞状细胞癌侵袭和转移过程中的意义。
  1  材料和方法
  1.1  病例选择
    选择2005年1月~2007年12月在我院口腔颌面外科手术治疗的原发口腔鳞状细胞癌病人50例,男34例,女16例;年龄29~80岁,中位年龄62.5岁。其中舌癌24例,颊癌、牙龈癌、口底癌、腭癌、唇癌共26例。所有病例均行原发灶扩大切除及颈淋巴清扫术,手术标本均经石蜡固定、苏木精-伊红染色,常规病理检查。按照UICC 2002年标准进行TNM分期[3],T1 期17例,T2期 20例,T3 期9例,T4 期4例;病理分级:高分化28例,中、低分化22例。有颈淋巴结转移者20例,无转移者30例。取其癌组织、癌旁正常组织(指肿瘤边缘外2.0 cm以上的黏膜组织)及颈清切除的颈淋巴结的石蜡标本进行研究。全部病例术前均未接受放疗或化疗。
  1.2 主要试剂和仪器
    鼠抗人P73和P53单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);PV 6000二步法免疫组化检测试剂盒(Zymed公司,美国);粘片剂APES(北京中杉金桥生物技术有限公司);PBS磷酸缓冲液(浓度0.01 mmol/L,pH 7.2~7.4);OLYMPUS显微镜(BH-2,日本);Sample PCI图像分析软件(美国)。 
  1.3 免疫组织化学染色
    存档的蜡块均经病理检查证实,用LEICA石蜡切片机做4 μm厚连续切片3张,1张作空白对照,2张行免疫组化染色。采用免疫组化通用型两步法染色,参照试剂盒说明书进行。用已知阳性切片做阳性对照,用缓冲液代替一抗做阴性对照。
  1.4 结果判断及图像分析
    以细胞核出现棕黄色颗粒作为P73、P53阳性细胞。对切片进行图像分析。将病理切片放在100倍的显微镜下,观察组织中各抗原的表达情况,然后在400倍的显微镜下随机选取3个视野。将每个视野图像摄入计算机,对图像进行裁剪,选定要测量的区域。将图像分割,利用颜色的差异把;热点”图像与周围的背景分开。对分割后的图像进行过滤和提取,然后由计算机对图像进行分析,得出结果。用平均吸光度(AOD)值表示抗原的表达水平,切片阳性表达的强弱与AOD值呈正相关。
  1.5 统计学处理
    结果应用SPSS 13.0 For Windows统计软件包进行分析。口腔癌旁组织与癌组织比较(方差不齐)采用Wilcoxon方法进行检验;口腔癌旁组织、高分化鳞状细胞癌、中低分化鳞状细胞癌(方差不齐)组织比较采用Mann-Whitney U方法进行检验;两检测指标与临床病理因素的关系及两检测指标之间的关系采用Spearman相关分析。
  2 结果
  2.1  口腔鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织中P73、P53蛋白的分布
    在癌旁正常黏膜中P73蛋白均阴性,P53蛋白大部分为阴性,仅少数病例基底层细胞核有弱阳性表达。口腔鳞状细胞癌P73与P53蛋白均定位于细胞核,少数可见胞浆弱阳性。染色分布形式不一,可出现在整个肿瘤区或肿瘤部分区域,胞核着色强度在不同病例之间或同一瘤体之内均有差异。分化好的癌巢中,蛋白积聚常位于癌巢边缘部分,中央部分的癌细胞染色阴性;分化较差的癌组织中,阳性细胞密集或弥散分布,阳性细胞数量较多。
  2.2 癌旁正常组织、高分化鳞状细胞癌、中低分化鳞状细胞癌组织P73、P53的表达
    口腔鳞状细胞癌组织中P73、P53的表达明显高于癌旁正常组织,差异有极显著意义 (u=2.798、2.913,P<0.01)。高分化鳞状细胞癌组织P73的表达与中低分化鳞状细胞癌比较,差异无显著意义 (u=1.132,P>0.05),但高分化鳞状细胞癌或中低分化鳞状细胞癌组织中的表达却明显高于癌旁正常组织(u=2.716、3.070,P<0.01)。P53的表达三者之间均有统计学差异,即中低分化鳞状细胞癌组织中的表达明显高于高分化鳞状细胞癌(u=2.11,P<0.05),高分化鳞状细胞癌中的表达明显高于癌旁正常组织(u=2.764,P<0.01)。见表1。表1  口腔鳞状细胞癌与癌旁正常组织P53、P73的表达(略)
  2.3 口腔鳞状细胞癌组织P73、P53的表达与临床病理指标的关系
    P73的表达与口腔鳞状细胞癌病人的性别、年龄、肿瘤生长部位、病理分级无明显的相关性;与T分期、生长方式、淋巴结状况呈明显正相关。P53的表达与口腔鳞状细胞癌病人的性别、年龄、T分期、生长方式、生长部位无明显的相关性;与病理学分级、淋巴结状况呈正相关,见表2。表2  口腔鳞状细胞癌组织P53、P73的表达与临床病理指标的关系(略)注:*P<0.05,**P<0.01
  2.4 口腔鳞状细胞癌P53、P73表达的相关性分析
    口腔鳞状细胞癌组织中P73与P53的表达无明显相关性(r=0.172,P>0.05)。
  3 讨 论  
    p53抑癌基因是细胞抑癌基因中研究最广泛和深入的基因之一。p53基因位于人17号染色体短臂,分为野生型和突变型。野生型p53基因是一种肿瘤抑制基因,参与细胞的分化调控,并以基因调控方式阻抑癌基因的活动,阻止异常染色体的形成。突变型p53基因表达则丧失抑癌功能,反而具有促进恶性转化的活性[4],与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后相关[5,6]。p73基因的表达产物P73蛋白与P53蛋白功能相似,在序列上具有同源性,被认为是候选的抑癌基因。P73蛋白对细胞生长和凋亡有双重调节作用,与多种肿瘤有关。在多种人类肿瘤组织中P73蛋白过表达,在正常组织中不表达。
  口腔鳞状细胞癌具有较高的侵袭性和淋巴结转移能力,早期的诊断和治疗具有重要的意义。有研究显示,p73、p53基因在口腔某些肿瘤组织中具有较高水平的表达,p73还可能参与了癌细胞的生长与增殖[8]。本文结果显示,P73在癌旁正常组织中表达的量很低,癌组织中的表达量明显升高,差异有统计学意义,但其表达在高分化鳞状细胞癌与中低分化鳞状细胞癌之间却无统计学差异。P73表达同时还与肿瘤T分期及局部淋巴结转移呈正相关。 
  P73表达随着肿瘤的增大、浸润及淋巴结转移而不断增高,说明了P73与口腔鳞状细胞癌的体积大小及肿瘤的淋巴转移有关,很可能参与了癌细胞的增殖、侵袭及转移,对预测口腔肿瘤的生长发展及淋巴转移具有一定的价值。这一结论与TANNAPFEL等[9]对肝细胞性肝癌的研究相一致。毛驰等[10]研究显示,P53阳性表达与口腔鳞状细胞癌病人性别、年龄、肿瘤大小、发生部位、病理分级以及淋巴结转移情况均无直接关系,同时亦未得出其表达和预后之间的关系。而国外亦有报道认为P53表达和临床病理指标之间无相关性,但是对于无淋巴结转移的病人P53阳性表达提示预后差[11]。GEISLER等也得出P53是头颈部肿瘤病人预后的因素之一的结论。本研究显示,P53的表达与病人性别、年龄、肿瘤部位、T分期、生长方式均无关,与肿瘤病理分级、区域淋巴结转移呈正相关性。说明P53蛋白与口腔鳞状细胞癌的恶性程度及肿瘤的淋巴转移有关。
    口腔鳞状细胞癌的发生发展是一个多基因相互作用的复杂过程,但癌基因、抑癌基因也有可能各自独立发挥一定作用。本研究结果显示,P73、P53蛋白阳性表达并无相关性。有人对头颈鳞状细胞癌组织中p53、p63、p73基因进行直接DNA序列检测,发现p53基因频发突变,而p63和 p73罕见突变。认为当p53基因发生突变时,p73、p63基因并不能取代p53基因的作用。因此,我们认为p73、p53基因可作为评估口腔鳞状细胞癌癌生物学行为和预后的独立指标。
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