【摘要】目的:探讨丝胶对2型糖尿病大鼠海马神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达的作用。方法:小剂量链脲佐菌素连续腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型,并给予丝胶灌胃。SP免疫组化染色观察海马神经元nN0S的表达。结果:nNOS免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状,位于海马神经元的胞浆。与正常对照组大鼠相比,糖尿病模型组大鼠海马神经元nN0S的表达明显升高P<0.01),丝胶治疗组大鼠海马神经元nNOS的表达明显低于糖尿病模型组P<0.01)。结论:丝胶可通过下调糖尿病大鼠海马nNOS的表达,减轻过量一氧化氮导致的神经毒性,发挥对海马的保护作用。

  【关键词】丝胶;2型糖尿病;海马;神经型一氧化氮合酶【中图分类号】R-587.1 【文献标识码】A 【文章编号11004-6879(2013)02-0097-03

  海马与认知功能密切相关,可直接干预信息贮存和回忆,且是缺血损伤敏感的脑区?。研究发现 ,糖尿病时存在认知功能障碍,表现为学习、记忆和解决问题的能力下降。丝胶是蚕茧中的水溶性蛋白质,约占茧丝的30%左右,民间有蚕茧泡水降血糖的验方。本课题组的前期研究发现,丝胶可明显降低血糖和保护糖尿病时胰岛细胞损伤 。本研究拟通过观察2型糖尿病模型大鼠海马神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)表达的变化,探讨丝胶保护糖尿病海马损伤的作用及机制。

  1材料与方法

  1.1 实验动物分组48只清洁级雄性SD大鼠,购自河北医科大学实验动物学部,合格证号:7l2024。48只SD大鼠随机分组:正常对照组(n=12),大鼠常规饲养,自由摄食、饮水;糖尿病模型组(n=12),建立2型糖尿病动物模型后,不再做任何处理;丝胶治疗组忙l2),建立2型糖尿病动物模型后,给予丝胶(2.4g/kg/d)灌胃35d;二甲双胍组(r1=l2),建立2型糖尿病动物模型后,给予二甲双胍(55.33mg/kg/d)灌胃35d。

  1.2 糖尿病动物模型的建立链脲佐菌素,临用时用pH4.4的枸橼酸钠一枸橼酸缓冲液配成2%的溶液,按剂量25mg/kg连续腹腔注射(3d),7d后以空腹血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。

  1.3 实验药物与试剂链脲佐菌素,美国Sigma公司l丝胶,彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成,蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供;盐酸二甲双胍,辽宁一成药业有限公司;血糖检测试剂盒,保定长城临床试剂有限公司;兔抗nNOS抗体,美国Santa Cruz公司。

  1.4 指标检测

  1.4.1 血糖:各组大鼠禁食l2h后4% 水合氯醛腹腔注射麻醉,经内眦于眶后静脉丛采血,3000r/rain离心20min,取血清采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

  1.4.2 海马nN0S表达的检测及定量分析:大鼠取血后4%多聚甲醛灌流固定,取脑,截取视交叉平面至大脑横裂的一段脑组织,4%多聚甲醛后固定过夜,常规石蜡包埋,连续冠状切片,片厚6um,自海马水平部出现后取片。SP免疫组化染色观察海马水平部神经元nNOS的表达,一抗稀释度为1:100,DAB显色,苏木素复染细胞核。以细胞浆出现棕黄色颗粒~-snNOS阳性反应,以PBS代替一抗作为阴性对照。采用MjVnt图像分析系统定量分析免疫组化阳性结果:10 x 20倍显微镜下于海马水平部CAl区任意选取3个视野,以阳性产物面积与视野面积的比值作为nNOS的相对表达水平,每例标本选取5张切片,取平均值。

  1.5 统计分析采用SPsS 15.0统计软件分析数据,行方差分析和两两比较的 检验。

  2结果

  2.1 血糖与正常对照组大鼠相比,糖尿病模型组大鼠的血糖明显升高P<0.01);丝胶治疗组、二甲双胍组大鼠的血糖明显低于糖尿病模型组P<0.01),且丝胶治疗组与二甲双胍组比较差异无统计学意义P>0.05)。见附表。

  2.2 海马神经元nN0s的表达心J0S免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状,位于海马水平部各区神经元的胞浆。

  与正常对照组大鼠相比,糖尿病模型组大鼠海马神经元nN0S的表达明显升高P<0.01);丝胶治疗组、二甲双胍组大鼠海马神经元nNOS的表达明显低于糖尿病模型组P<0.O1,P<0.05),且丝胶治疗组与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

  3讨论NOS有三种同工酶,分别是内皮细胞中的内皮型Nos、神经元中的nNOS和血小板、巨噬细胞、胶质细胞中的诱导型NOS,它们均可催化产生精氨酸产生一氧化氮(NO)P1。nNOS是钙离子依赖性酶,主要存在于神经元内。

  生理情况下,nNIDs的活性较低,通过合成N0发挥调节脑血流,介导神经元兴奋性毒性及炎性损害等多种作用 。但nN0S与脑组织缺血缺氧密切相关,脑血氧供应减少可导致其表达上 。本研究亦证实了这一点。糖尿病微血管病变可使毛细血管基底膜增厚、血管内皮细胞发生增生性改变,使毛细血管管腔变狭窄,再加上糖尿病患者脂代谢紊乱引起血流减慢,导致脑血流量减低,脑组织缺血缺氧,因此海马nNOS的表达明显升高。海马缺血缺氧激活nNOS,导致NO过量生产。NO是一种高度游离的气体分子,在肿瘤杀伤、免疫防御、血管平衡及神经传导等方面发挥重要作用 。神经系统内,一定量的NO可参与长时程增强(LTP)的产生与维持,但过INO可产生神经毒。另外,过量NO可与超氧阴离子结合介导多种细胞损伤。

  我国糖尿病患者多以服用西药控制血糖,在长期服用西药的患者中,有很多人早期即可出现肝肾损害,因此西药的毒副作用不容忽视。蚕茧由丝胶和丝素两部分组成,我国应用蚕茧已有几千年的历史,但主要是将丝素用作衣料;丝胶是蚕丝中包被在丝素外面的高分子水溶性蛋白,具有多种生物学活性,但在缫丝时作为废料丢弃。