本文是一篇专业的医学论文，主要是关于非小细胞肺癌组织DAPK基因甲基化状态分析，详情请看下面的介绍。
1材料与方法
1．1研究对象标本取自2Ol1年9月～2012年1月在安徽医科大学附属医院接受外科手术、并经病理学确诊的96例NSCLC患者，其中男性83例，女性13例。年龄32～78岁，平均年龄59．43岁。癌组织为患者进行外科手术时切除的肺肿瘤组织，癌旁组织为距离肿瘤部位3cm以上的正常组织，取癌组织和癌旁组织各1cm。，立即放入液氮冻存。
1．2方法用甲基化特异性PCR(methylationspecifcPCR，MSP)技术[2检测96例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织的DAPK基因启动子区甲基化状态，统计学分析检出率的差异。再将96例患者的癌组织按以下方法分别进行分组：按肺癌的临床分期分为0～I期28例，Ⅱ～Ⅳ期68例；按不同病理分型分为鳞癌51例，腺癌及其他45例；按不同临床分类分为中央型40例，周围型56例；检测甲基化状态，分析组间统计学差异。
1．2．1基因组DNA的提取：用Qiagne试剂盒分别提取癌组织和癌旁组织基因组DNA，提取步骤见试剂盒说明。
1．2．2DNA修饰与纯化：用现配的3mol／L的NaOH，i0mol／L的hydroquinone氢醌和3．9mol／L的亚硫酸氢钠对提取的DNA进行修饰。
过程包括DNA与NaOH混匀变性，再加入氢醌和亚硫酸氢钠，加水定容，石蜡油覆盖，避光55℃孵育等。经过亚硫酸氢钠修饰，CpG中未甲基化的C将被转变成U，甲基化的C则不发生变化，因此用不同引物对其进行PCR扩增可以判断样本是否发生甲基化。再用PromegaWizardDNA纯化系统对其进行纯化。具体实验步骤见PromegaWizardDNA纯化系统说明书。
1．2．3PCR反应及产物分析：25lMSP反应体系，包括Q液5．01，Buffer2．5l，10mmol／L的dNTPs0．51，20gmol／L的上、下引物各0．3l，HotstarTaq酶0．75单位，修饰后的DNA5．0l。反应条件为：95℃预变性15min，94℃热循环50S，退火50s，72℃5OS，共35个循环，后72℃延伸10min。
DAPK甲基化，上游引物5’一GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC一3，下游引物：5’。
CCCTCCCAAACGCCGA一3，扩增产物为98bp，退火温度为54℃；DAPK非甲基化，上游引物：5一GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT一3，下游引物：5一CAAATCCCTCCCAAACACCAA一3，扩增产物为106bp，退火温度为54℃；引物均由上海生工生物工程公司合成。
PCR扩增完成后，取8l扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断该样本的DAPK基因发生甲基化的标准是非甲基化引物能扩增出条带，甲基化引物也扩增有条带。
1．3统计学分析
1．3．1采用SPSS13．0软件包分析数据。
1．3．2采用卡方检验分析甲基化率的统计学差异，主要指标是P值和OR值，P≤0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1癌组织和癌旁组织DAPK基因甲基化状态分析96例肺癌组织和相应的癌旁组织样本的检测结果显示，49例癌组织样本发生甲基化，占51；l2例癌旁组织样本发生甲基化，占12．5；卡方检验显示癌组织和癌旁组织的甲基化率差异有统计学意义。一32．893，P一0．000。
2．2不同临床分期、临床分类和病理分型肺癌组织DAPK基因甲基化状态分析见表1。表中所示肺癌0～I期与Ⅱ～Ⅳ期的DAPK基因甲基化率差异无统计学意义，；p=0．017，P>0．05；中央型与周围型相比，差异无统计学意义。一3．603，P／，0．05；鳞癌与腺癌及其他组相比，差异无统计学意义，一0．157，P>0．05。
3讨论用MSP方法检i贝4抑癌基因的启动子区域CpG岛甲基化状态，具有简单灵敏快速的特点，目前在肺癌的表观遗传学研究中应用较为广泛。
本实验研究结果表明，肺癌组织与癌旁组织DAPK基因甲基化状态有显着差异，而癌组织是否发生甲基化与肺癌的不同临床分期、不同临床分型和不同病理分型则无明显相关性，这与以往相关研究基本一致，因而检测有关样本的DAPK基因的甲基化，可能成为肿瘤临床诊断的指标，且其应用范围不受肺癌临床分期、临床分型和病理分型的限制。
华海蓉等研究云锡矿工肺癌DAPK基因的蛋白表达和异常甲基化，采用免疫组化检测到云锡矿工肺癌中DAPK蛋白表达阳性率明显低于正常组织，并通过细胞凋亡检测发现DAPK蛋白表达阳性的肺癌组织中肿瘤细胞凋亡高于该蛋白表达阴性的组织。推测DAPK蛋白表达缺失使其促凋亡作用减弱，可能是肺癌发生的机制之一。彭再梅等研究了82例肺癌患者诱导痰和对应的癌组织以及25例肺部良性病变组织中DAPK基因的甲基化状态，发现诱导痰和肺癌病理组织的甲基化检出率具有良好的一致性，且与良性病变组织(甲基化检出率为零)相比，差异具有统计学意义，说明检测肺癌患者的诱导痰脱落细胞DAPK基因甲基化水平也可以作为诊断肺癌的指标之一。林勃等检测了80例NSCIC患者的血清DAPK基因甲基化水平，甲基化率为31．3％，提示血清DAPK基因甲基化可作为肺癌早期辅助诊断的分子标志物。
这些研究与本研究一致表明，分析DAPK基因的甲基化状态来诊断肺癌的理论研究已经为该方法应用于临床实践提供了较为可靠的依据。
