ABCA1(ATP-binding cassette transporter)基因属于ATP结合盒转运子(ABC)基因超家族中的一员，其基因缺失与Tangier病和家族性高密度脂蛋白(HDL)缺乏症有关。ABCA1在胆固醇逆转运和HDL生成的起始步骤中起着重要作用。ABCA1表达主要受激素核受体的调节，如过氧化物酶增生激活型受体(peroxisome proliferator-aetwated recep．tor，PPAR)、肝x受体(1iver X receptor，LXR)及视黄酸X受体(retinoid X receptor，RXR)等核受体对ABCA1的调节。Zhang等 用LXR激动剂TO901317处理HepG2细胞，发现apoM的表达随着时间及剂量加大而下调。而Calayir等 在肯定这一结果的同时，却发现在鼠的小肠及人结肠腺癌细胞Caco一2中，apoM 和apoAI的表达大幅上调，且ABCA1的表达量更是上调了250％ ～430％ 。研究表明，LXR在天然配体22(OH)C作用下形成LXR／RXR异二聚体并上调apoM的mRNA及蛋白水平，且LXR及肝受体同系物(1iver receptor homolog．1，LRH1)是apoM 的直接调节因子。近刘杨等用LXR激动剂TO901317处理人肝癌细胞株HepG2的基础上加入ABCA1阻滞剂DIDS，却发现apoM的表达水平进一步下降。结果表明，ABCA1影响HepG2细胞内apoM mRNA的表达，但ABCA1是否通过LRH1途径间接调节apoM的表达并不明确。为了明确ABCA1是否通过对LRH1的调节而影响apoM的表达，我们首先激动LXR，使其靶基因ABCA1高表达，然后阻滞ABCA1功能，检测LRH1及apoM mRNA水平的表达。

　　1 材料与方法

　　1．1 试剂和细胞LXR激动剂GW3965及T0901317、ABCA1阻滞剂DIDS(4，4’-diisothiocyanatostilbene-2，2’-disulfonate)购自美国Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine8eFtlm，FBS)、RPMI一1640培养基、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均购自美国Gibco公司，Trizol总RNA提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司，cDNA首链合成试剂盒购自Fermentas公司，GAPDH、apoM、apoAI、ABCA1及LRH1引物由上海生工生物工程有限公司合成。HepG2细胞购自上海中国科学院细胞研究所。

　　1．2 方法

　　1．2．1 细胞培养HepG2细胞在标准条件下(5％CO 、37℃)，用含10％FBS、青霉素(100 U／m1)及链霉素(100 m1)的RPMI一1640培养。首先用75cm 的培养瓶扩大培养，调整细胞状态。

　　1．2．2 药物作用 GW3965及TO901317溶于DM．SO，DIDS溶于含0．5％BSA的RPMI一1640中。取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，计数后接种至6孑L板(接种浓度为1 X 10 ／孔，含10％ FBS的RPMI．1640培养基3ml／L)，待细胞融合生长至50％ ～70％ 。在开始实验前，用磷酸盐缓冲液(2 ml／L)洗2次，再用无血清的RPMI一1640培养基(2 ml／／孑L)洗1次，然后分别加入药物孵育24 h。

　　1．2．3 实验分组DMSO组(对照组)；GW3965组(分为1、2．5、10mol／L 3小组)；10mol／LGW3965+DIDS组(按DIDS 100、400 ixmoL／L分为2小组)；10mol／L TO901317组。以上各组均含0．033％ DMSO。

　　1．2．4 细胞总RNA提取操作根据总RNA提取试剂盒说明书进行，使用核酸蛋白检测仪检测核酸浓度和纯度，取波长260／280处的吸光度(A)值在1．8～2．0的标本进行逆转录。

　　1．2．5 逆转录 每孔的RNA均取2 g进行逆转录，按cDNA首链合成试剂盒使用说明书操作，在定性PCR仪中进行反应，逆转录后的cDNA保存于一20℃ 。

　　1．2．6 引物及探针的设计和合成人apoM、apoAI、ABCA1、LRH1及GAPDH等引物和探针的合成均采用Primer Premier 5．0软件设计。GAPDH、apoM、apoAI、ABCA1及LRH1引物和探针的序列见表1。

　　1．2．7 RT．PCR 所有PCR反应在Light Cycler荧光定量核酸检测仪上进行，每个标本均做复管。

　　apoM、ABCA1、LRH1及GAPDH等的检测均一次进行。PCR总反应体系：10 X buffer 2．5 ，25 mmol／LMgC12 2．5 l，10 mmolfL 4 X dNTPs 0．5 ，100mol／L正义引物0．1 txl，100 pmol／L反义引物0．1 txl，100 tzmol／L探针0．1 p,1，5 U／ l Taq酶0．25l，标本2 Ixl，PCR级水补足至25l。热循环条件为95℃ 10 min；然后95℃ 15 s及60°C 1 min，扩增40个循环。每次检测均用10 一10 拷贝／ml的标准品建立标准曲线，对未知浓度的标本进行定量。

　　1．2．8 apoM、ABCA1及LRH1等基因的表达计算方法 以同一孔apoM(ABCA1或LRH1等)含量与GAPDH mRNA含量的比值表示apoM(ABCAI或LRHI等)基因的表达水平。

　　1．3 统计学处理采用GraphPad Prism 5．0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，实验组与对照组间比较采用Dunnett s．t检验，两组间均数比较采用t检验，P<0．05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 GW3965对相关基因的影响与DMSO组比较，2．5及10mol／L GW3965组ABCA1 mRNA水平分别是DMSO组的9．82倍、12．30倍、15．48倍(均P<0．0l，见图1A)。LRH1mRNA水平分别比DMSO组下降17．4％ (P >0．05)、38．69％ (P<0．O1)、51．31％ (P<0．01)。而apoM和apoAI mRNA表达水平则没有明显变化(P>0．05，见图1B)。另外，10txmol／L GW3965组与DMSO组细胞上清中的胆汁酸均值分别为3．075和3．080 ixmol／L，差异无统计学意义(P>0．05)。

　　2．2 10pmol／L TO901317对相关基因的影响与DMSO组比较，ABCA1 mRNA水平升高9．61倍(P<0．01)，LRH1及apoM的mRNA水平分别下降33．1％、31．2％ ，差异均有统计学意义(均P<0．05)。

　　3 讨论既往研究表明，apoM主要表达于肝脏和肾脏，胎肝与胎肾中亦有少量表达。新研究发现，apoM在正常的结肠组织及结肠癌组织中亦有不同程度的表达。apoM通过影响前B高密度脂蛋白(preBHDL)的形成调节HDL的代谢，促进胆固醇逆转运，具有抑制动脉粥样硬化发生的作用。

　　LRH1是一种重要的转录因子，可与apoM近端启动子上(-29／-25)序列CAAGG3’结合而调节apoM的表达，在HepG2细胞中，Ventenclef等 分别用基因干扰、腺病毒介导过表达技术作用LRH1，发现apoM表达随之降低或升高；并且LRH1通过类似的方式直接参与调节apoAI的表达；ABCA1影响apoM的表达，但ABCA1是否通过LRH1间接调节apoM的表达尚不明确。因此，本研究主要探讨ABCA1与LRH1之间的关系及对apoM 表达的影响。

　　本研究结果显示，TO901317作用于HepG2细胞后，LRH1及apoM mRNA水平均明显下降(均P<0．05)。TO901317不仅是LXR激动剂，而且是FXR的激动剂，并且FXR．SHP途径抑制LRH1表达在肝组织中被证实存在并发挥作用。因此，LXR激动剂TO901317能下调体内肝脏及HepG2细胞的apoM mRNA，可能是由于TO901317在激动LXR作用的同时，也激动FXR．SHP途径，抑制LRH1而下调apoM的表达，并且这条途径的抑制作用，大于LXR升高apoM的效应，呈现HepG2细胞中apoM表达下调的现象。有研究表明，另一种LXR激动剂GW3965仅对LXR有较强的激动作用，而对FXR没有明显作用。因此，我们用GW3965作用于HepG2细胞，结果显示，GW3965显着升高HepG2细胞的ABCA1 mRNA水平，同时呈剂量依赖性下调LRH1的表达。而apoM和apoAI mRNA却无明显变化。由于GW3965对FXR没有激动作用，但LRH1却显着下降，因此我们考虑是否是细胞上清中代谢产物胆汁酸的作用，胆汁酸是FXR的天然激动剂，但是我们测得对照组与10mol／LGW3965组的细胞上清中胆汁酸水平的差异并无统计学意义，表明该因素在本研究中并不发挥作用。

　　以上结果表明LXR激动剂GW3965通过其他某种途径下调LRH1 mRNA水平，ABCA1高表达并不抑制apoM的表达。

　　本研究结果还显示，10moL／L GW3965升高ABCA1 mRNA相对水平(15．48倍)的作用明显大于TO901317(9．61倍)的作用。同时GW3965不下调apoM 的表达，而TO901317却明显下调apoMmRNA水平。这表明LXR靶基因ABCA1可能具有上调apoM表达的作用。而GW3965和TO901317分别作用HepG2细胞，ABCA1 mRNA显着升高的同时，LRH1表达明显下调，这表明ABCA1与LRH1之间可能存在着负相关关系。我们用不同浓度的ABCA1阻滞剂DIDS作用于HepG2细胞，apoM表达水平的差异无统计学意义。而在GW3965基础上联合应用DIDS作用于HepG2细胞，以明确ABCA1是否通过LRH1调节apoM 表达的推测，但结果表明apoM mRNA水平呈剂量依赖性下降，并且10moL／L GW3965 +400mol／L DIDS组与10 pmol／LGW3965组比较，apoM与apoAI水平明显下降，而LRH1 mRNA水平却没有明显变化。这些结果表明，在HepG2细胞内，ABCA1不参与下调LRH1的作用，并从反面说明ABCA1可能具有上调apoM表达的作用。Calayir等 的动物实验结果亦表明，TO901317可同时下调小鼠肝脏apoM和apoAI表达；本研究结果亦显示apoAI与apoM的变化趋势相同，表明两种载脂蛋白极可能有共同的调节通路。

　　综上所述，在HepG2细胞中，ABCA1不通过LRH1这条途径调节apoM的表达。详细机制还需进一步研究。