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  1 XLA的治疗研究
  免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内,使之发挥功能,以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植,总存活率为62%,其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓(matched unrelated marrow donor,MUD)移植在近年已很盛行,成功率约为50%,5岁以内接受移植者可达85%[23]。近年开展脐血干细胞移植,存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植(腹腔注射)已有成功的报道[5]。
  将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内(基因转化),随细胞有丝分裂,转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲,凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针[24]。基因治疗PID的尝试已经历多年,取得一定成效,但尚处于探索和临床验证阶段[25]。Faust等[26]的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTK cDNA转录至两组免疫缺陷鼠(XLD或BTK-/-鼠)。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%;而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞,两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低,但较XID小鼠有所提高。Drabek等[27]通过人类BTK cDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗,纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能,并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段,此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达,并在其他组织均有低水平表达。
  经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现,BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外,Rohrer等[28]通过动物实验证实,应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测,即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益,为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说,尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离,但经过近10年的临床试验,人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信,XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。 
 2.  BTK基因的分子结构及其突变分析
  在20世纪80年代,多位学者应用DNA多态性标志分析的方法,成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部(Xq21.3-22)的2cm区域内[8]。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因,该基因表达于正常人各期B淋巴细胞,在XLA患者中发生突变,故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb,含有19个外显子,除第一外显子外,其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸,分子量为76KD[9]。cDNA含有2560个核苷酸,有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架,起始密码子在核苷酸第133位置上,在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析,迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失,其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子,还涉及内含子和启动区域。其中,发生频率最高的是错义突变,其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变,这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸,这是目前认为的最常见的突变热点[10],而突变高频位点R520也属于CPG突变[6]。编码外显子蛋白突变的区域[11](见表1)。表1  编码外显子蛋白突变的区域
  3  BTK的分子致病机制
  BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶,该类激酶广泛参与细胞信号传导,影响细胞的存活、增殖和分化,BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达,而BTK基因突变只影响B细胞的数量,这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下:BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3,4,5-risphosphate与膜结合,Pl-3,4,5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后,BTK经过两步活化:首先BTK激酶段Y551位磷酸化(很可能是与Lyn作用),接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白(BLNK)结合并激活phospholipase C -γy(PLC-γ),导致钙离子通道打开,胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号,至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据[1,12]。该
  信号传导途径受FcRⅡB和SHIP( SH2-containing inositol-5-phosphatase)磷酸酶介导的另一途径制约,通过水解Pl-3,4,5-risphosphate和Ins(1,3,4,5)-etraphosphate关闭钙离子内流通道[13]。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活,也可以通过其他很多受体激活,包括G-protein-coupled receptors( GPCR)、IL-3、IL-5和IL-6,另外,CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK[13],近年来研究表明,CD40也是B细胞发育过程中的重要受体,传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似,CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平,是独立于BTK的信号传导通路[14~16]。BTK在细胞内与很多分子相互作用,共同构成了一种微环境,在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用,其中与PH段作用的分子研究得很多,R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2与磷酸化的BLNK作用。另外,SH3与TH在BTK分子内作用,抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中,Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用,磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多,但是它们如何协调地与BTK作用,完成BTK参与的信号传导,机制目前尚不清楚[17,18]。

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