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  NMDAR是中枢神经系统内一类重要的EAA受体,广泛存在于中枢和外周神经系统。NMDA受体由NR1、NR2、NR3A三部分组成。对NMDA受体来说NR1是不变的[2],它是NMDAR药理学和电生理学特  性的基础,而NR2A、B、C、D亚型单独存在时并不表现受体活性,只是在与NMDAR1结合后决定离子通道开放的时间,并调节受体兴奋剂及拮抗剂的作用。因此,DHCA再灌注后脑NMDAR1表达的变化即可反映NMDAR在DHCA再灌注后的变化。DHCA对大脑的损伤机制有许多假说,其中Kris-tian等[3]认为EAA在DHCA脑损伤中起主要作用,DHCA期间,脑组织缺血缺氧导致突触前EAA大量释放和再摄取减少,从而激活突触后NMDA和AM-PA受体,使位于离子通道内起阻断作用的镁离子释放,NMDA 受体介导的钙通道及电压敏感的钙通道开放。一方面使Ca2+、Na+、水进入细胞内,K+大量流出   细胞膜,引起水钠潴留导致神经元急性肿胀坏死;另一方面钙离子大量内流导致细胞内钙超载,钙离子激活一系列与细胞毒性有关的酶,如蛋白激酶C、磷脂酶等,经过这些酶的共同作用,最终引发神经细胞膜降解、细胞骨架解体、DNA 断裂,直至细胞死亡。
  MP脑保护作用机制复杂,包括抗炎、阻断氧自由基诱导的脂质过氧化、维持组织血流量和有氧能量代谢等。Langley等[4]研究发现MP处理组DHCA后大脑氧代谢率、脑血流量明显高于对照组,表明DHCA前MP预处理能有效地保护脑组织。Baumgartner等[5]通过以狗为模型DHCA2 h后,发现谷氨酸等兴奋性氨基酸大量释放引起较严重的脑损害。较多研究表明,MP对DHCA大脑具有保护作用,但并没有探讨其保护机制[4,6]。大量研究表明,具有神经保护作用的干预方法不仅可以减轻脑缺血再灌注病理损伤过程,同时可使NMDAR的表达下调。本研究发现,DHCA模型组大鼠脑NMDAR1蛋白表达从再灌注2 h起开始升高,于24 h到达高峰,其机制可能是DHCA后脑释放大量谷氨酸作用于突触后膜NMDAR1的谷氨酸结合位点,使神经细胞处于兴奋状态,NMDA受体转录和翻译活性增大,对表达起上调作用。另外在DHCA再灌注后期NMDAR1表达明显降低,其机制可能与早期细胞坏死和凋亡、细胞功能被抑制、健存细胞大量减少以及NMDAR基因转录和翻译功能下降等因素有关;也可能与受体内化有关。大鼠DHCA后脑组织  因缺血释放大量谷氨酸,致NMDAR1过度激活,使大量NMDAR1发生内化,其结果不仅增加了NMDAR1自身的代谢过程,减少胞膜表面NMDAR1的密度,同时还可能发挥某种信号作用(包括下调NMDAR mR-NA 的转录)[7]。
  1 材料与方法
  1.1 仪器与试剂
  早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛(南京市儿童医院提供)、MP(美国辉瑞制药公司)、NMDA受  体R1 (Santa Cruz公司),羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022(武汉博士德公司)、DAB显色剂(武汉博士德公司)、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)、荧光倒置显微镜(德国蔡司)、801图像分析系统(江苏  捷达)。
  1.2 动物
  成年健康雄性普通级SD大鼠(南京医科大学实验  动物中心)175只,体重250~300 g,随机分为3组,A组(假手术组)15只;B组(DHCA模型组)和C组(MP处理组)各80只,每组再分为DHCA后2、6、12 h,1、2、3、7 d共7个小组,每小组10只,其中DHCA后6 h、1 d 两个组为15只。术前6 h 禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉,不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30 min腹腔注射MP,剂  量为30 mg ·kg-1。
  1.3 大鼠DHCA模型建立
  术前30 min肌肉注射阿托品0.02 mg·kg-1,5%水合氯醛6 ml · kg-1腹腔注射麻醉,大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3 cm,用胶带将其与鼠尾相  固定,监测肛温。颈部正中切口,分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉,并双重过线。游离一侧股动脉,动脉置管,取动脉血作血气分析后,用肝素充满连接管后接压力换能器,多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝,物理降温,每隔5   min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度,调整降温速度。当肛温降至21 ℃时,将大鼠取出,取动脉血做血气分析后,经左股动脉进行肝素化(肝素钠300 IU ·kg-1)。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉,扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉,最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉,扎线固定   留置针,与左侧颈外静脉的静脉留置针相连,开始转流。转流后,将体温维持在(21±1)℃之间,并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60 min后,拔出颈外动脉处留置针并结扎,回收其管道内血液,经左侧颈外静脉输入,再退出其管内留置针并结扎。最后  松开两侧颈总动脉处动脉夹,恢复颈总动脉血流,检查穿刺处无出血后,逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35   ℃早产儿培育箱复温,恢复正常体温4 h后放置室温下正常饲养。
  1.4 免疫组化方法
  检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点,用含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定,断头置于冰盒玻璃板上取出全脑,放入同样固定液中再固定约24 h,常规脱水石蜡包埋切片,厚度4μm,取4张连续切片,操作步骤按SABC试剂盒  操作说明进行,阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值,每张切片随机选择4个高倍视野(×400)观察并取其平均值,以灰度值来表示NMDAR1的表达水平,灰度值越高,免疫组化染色越浅,NMDAR1表达越低。
  1.5 脑组织超微结构观察
  于DHCA再灌注后6 h和1 d,各组取5只大鼠处死,每只大鼠于海马区取1 mm×1 mm×1 mm的小块  组织,于2.5%戊二醛固定后,经0.1 mol·L-1的磷酸  缓冲液冲洗,1%锇酸固定,丙酮脱水,纯树脂浸透包  埋,固化后切片。切片厚度为50~60 nm,醋酸铀与枸缘酸铅染色,透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。
  1.6 统计学处理:所有数据以x-±s 表示,用SPSS 11.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析并以LSD法比较两两差异,P <0.05 为差异有统计学意义。
  2 结  果
  2.1 免疫组化表达
  见表1。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑  NMDAR1蛋白从再灌注2 h起开始升高,于24 h到达高峰( P <0.01),后逐渐下降,于7 d后基本恢复正常  水平。同时在2、6、12 h,1、2 d 5个时间点,MP组大鼠  脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组(P<0.01 )。表1 各组大鼠各时间点脑NMDAR1蛋白表达(略)。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑组织在DH-CA后6 h脑组织超微结构未见明显区别,基本正常; DHCA 后1 d模型组出现神经胶质细胞凋亡(图1),MP处理组未见明显异常(图2)。
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