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应用荧光探针H2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究
目的应用荧光显微镜及新型荧光探针 H2DCF-DA检测在光源照射过程中人脐静脉血管内皮细胞(ECV 304)内活性氧的产生情况.方法将 ECV 304细胞接种于 35 mm培养皿中,24 h后加入 H2DCF-DA,使其终浓度为 10μmol/L,孵育 30 min.利用荧光显微镜的激发光源作为照射光源,在采集荧光图像的同时完成光源照射,光源输出波长范围为 460～490 nm,功率密度约为 100 mW/cm2.连续采集 DCF的荧光图,观察细胞内 DCF荧光的变化情况,采用计算机图像处理和分析技术,求得细胞内不同照射时间点 DCF平均荧光强度,进而得到平均荧光强度-时间曲线.另外,使用线粒体特异标记探针 MitoFluor Red 589与 H2DCF-DA共同孵育细胞,分别采集同一细胞的 DCF的荧光图和 MitoFluor Red 589的荧光图,并利用像素-荧光强度分析方法来确定 DCF荧光在细胞内的分布位置.结果在光源照射的开始阶段,ECV 304细胞内的 DCF荧光强度迅速增加,在第 10s时便上升至第 2s时的 2.2倍,但是随着照射时间逐渐延长,荧光强度增幅逐渐变小,到第 60s时上升至第 2s时的4.7倍.观察时间进一步延长,DCF的荧光强度的变化似乎进入平台期,继而开始出现下降.考察 DCF荧光在 ECV 304细胞内的分布位置主要通过比较细胞内不同区域的 I1/I2值,通过图像分析与计算得到线粒体区、细胞核区以及细胞质非线粒体区内 I1/I2值分别为 1.9490±0.2209、1.1128±0.2256、0.9413±0.0853.结论荧光探针技术和图像分析技术应用于细胞内活性氧的检测,方法简便、结果可靠.光照可致 ECV 304细胞内活性氧产生,且主要位于线粒体内,这可能与线粒体内内源性光敏物质丰富有关,但尚不能完全排除该荧光探针自身性质致使上述现象出现的可能.
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光疗法治疗阿尔茨海默病的基础和临床研究进展
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发现至今已有百年,而现有临床药物并不能逆转其病情恶化,亟待研发新的药物和治疗方式.大量基础研究表明:弱激光治疗(Low-level laser therapy,LLLT)可通过多种途径调控神经元功能,减少老年斑(Senile plaques,SP),挽救AD小鼠受损的记忆.此外,临床研究表明LLLT能提高AD患者的记忆与生活自理能力.国外学者研发了远红外(1 072 nm)激光治疗仪,并逐步应用于AD的治疗.笔者发现630 nm高能红光(High-energy red light,HERL)对APP/PSI-转基因小鼠损伤的记忆有显著的挽救作用,这为临床研发HERL的护脑仪及治疗AD提供了理论基础.
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激光辐照血液疗法治疗缺血性脑血管疾病机制的探讨
光辐照血液疗法包括紫外光辐照血液、激光辐照血液、He-Ne激光血管内照射、氧载体辐照、血磁等血液物理治疗方法.自20世纪80年代激光辐照血液疗法从国外引入并应用于临床,治疗缺血性脑血管病,疗效较为显著.许多学者对弱激光治疗缺血性脑血管疾病的作用机理进行了大量的研究.
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810nm弱激光对M1型骨髓源性巨噬细胞的作用及其机制
目的:体外建立M1型骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)-弱激光照射模型,探讨弱激光照射对M1型BMDM炎症因子分泌的影响及其可能机制.方法:体外分离BALB/c小鼠BMDM,应用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)条件性培养基培养,流式细胞术检测巨噬细胞标志物F4/80的表达,确定所获得细胞为纯度较高的BMDM.应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24h诱导原代BMDM向M1型BMDM方向极化.将细胞随机分为弱激光治疗(low level laser therapy, LLLT)组和对照组,LLLT组采用810nm波长激光照射,光斑面积4.5cm2,照射功率密度2mW/cm2,照射持续440s,终获得照射能量为4J,对照组置于暗箱,不进行照射.应用CCK8实验测定细胞活性,RT-PCR检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β (interlukin-1β,IL-1β)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthases,iNOS)的mRNA表达情况,ELISA检测TNF-o及IL-Iβ蛋白分泌,Western blot测定iNOS和M1型巨噬细胞极化的重要转录因子核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B,NF-κB p65)的表达.组间比较采用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果:LPS刺激后,使用弱激光照射的M1型BMDM细胞活性显著提高,升高至对照组的2.313±0.630倍(P＜0.05).LLLT组IL-1β mRNA表达为0.586±0.145,对照组为1.000±0.022,两组比较有统计学差异(P＜0.05);LLLT组TNF-α的mRNA表达为0.862±0.152,对照组为1.000±0.082,两组比较无统计学差异(P=0.082);LLLT组iNOS的mRNA表达为0.720±0.039,对照组为1.000±0.024,两组比较有统计学差异(P＜0.05).对照组TNF-α为270.478±26.831 pg/ml,LLLT组为209.365±5.600pg/ml,两组比较有统计学差异(P＜0.05);对照组的IL-1β为98.941±12.430pg/ml,LLLT组为77.076±2.023pg/ml,两组比较有统计学差异(P＜0.05).对照组的iNOS蛋白表达为1.005±0.075,LLLT组为0.210±0.010,两组比较有统计学差异(P＜0.05);对照组NF-κB p65蛋白表达为1.006±0.260,LLLT组为0.428 ±0.169,两组比较有统计学差异(P＜0.05).结论:810nm LLLT M1型BMDM可抑制其炎性因子IL-1β及iNOS的mRNA表达,下调炎性因子IL-1β及TNF-α的分泌,降低M1型BMDM表面标志物iNOS的表达,同时显著下调M1型巨噬细胞经典极化转录因子NF-κB p65的表达.810nm LLLT可调控M1型巨噬细胞的极化状态,抑制其炎性因子分泌,该调控作用和其下调M1型巨噬细胞经典极化转录因子NF-κB p65有明显相关性.
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630～650nm可见光对小鼠创面愈合的影响研究
目的 研究630～650nm可见光对小鼠创面愈合的影响,探讨其调控炎症反应的机制.方法 40只C57BL/6雄性小鼠以脊柱为对称轴,在背部中间两侧对称性制作直径8mm的圆形全层皮肤缺损模型.小鼠左侧创面设为实验侧组,右侧创面设为对照侧组.制模完成后实验侧组创面立即用630～650nm红光治疗仪照射,对照侧组创面用LED台灯照射.观察并比较两组创面不同时点的创面愈合率;采用免疫组化方法检测创面中性粒细胞(PMN)、巨噬细胞(Mp)等炎性细胞的浸润情况;采用ELISA法检测创面TNF-α、IL-6的表达水平.结果 制模后3、7、12d,实验侧组创面愈合率均高于对照侧组(均P＜0.05).制模后24h、3d,实验侧组创面PMN、Mψ浸润均较对照侧组减少(均P＜0.05).制模后12、24h,3、7d,实验侧组创面IL-6、TNF-α表达水平均低于对照例组(均P＜0.05).结论 630～650nm可见光能适度减少小鼠创面炎性细胞的浸润,抑制炎性因子分泌,在一定程度上降低炎症反应强度,有效促进急性创面的愈合.
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弱激光促进神经再生的生物刺激作用
神经损伤在临床很常见,但其临床治疗效果不理想[1],因此探索有效的治疗方法促进损伤后的神经再生很有必要.目前神经损伤后的治疗措施已经趋向多样化,其中弱激光疗法在近20年来越来越受到重视,虽然早在1978年就有人用弱激光治疗周围神经损伤[1],但直到80年代后期才引起研究人员的关注,并有大量的实验研究证实,弱激光治疗能有效促进损伤神经的再生修复.
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激光治疗在颞下颌关节紊乱病中的应用
颞下颌关节紊乱病（ TMD）是口腔临床常见疾病之一，病因多样，治疗方法也多种多样。近年来，激光治疗在TMD中的应用受到人们的关注。本文就激光在TMD治疗中的疗效、疗效评价、作用机制及相关影响因素进行综述。
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弱激光治疗减轻正畸过程中疼痛的临床疗效评估
目的:研究弱激光治疗在减轻正畸导致疼痛的临床效果.方法:120名初次佩戴正畸弓丝的正畸患者随机等分为弱激光治疗(LLLT)组、安慰剂组和对照组(n=40).LLLT组患者在佩戴正畸弓丝后即刻给予每颗牙齿颊、舌侧激光照射;安慰剂组仅将激光光纤放置在患者正畸牙齿颊、舌侧但不予激光照射;对照组患者不做任何处理.在佩戴弓丝的第1周内,对每名患者进行问卷调查,记录每一天的正畸疼痛情况.结果:LLLT组患者疼痛开始时间以及疼痛的发生时间与其他两组没有区别(P>0.05),但是疼痛消失时间早于其他两组(P<0.05);并且在正畸弓丝带入第1周内各时间点,LLLT组的正畸疼痛分值低(P<0.05),疼痛时的疼痛程度也低(P<0.05);LLLT组患者对治疗的满意度高于其他两组(P<0.05).结论:弱激光治疗可减轻患者初次佩戴正畸弓丝所导致的疼痛,并缩短疼痛时程.
