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荧光碳点在细菌成像及抗菌领域应用的研究进展

时间:2019-08-13 09:11来源:未知 作者:360论文网 点击:

  荧光碳点在细菌成像及抗菌领域应用的研究进展

  孟阳1 王柳然1唐秋玲1 丁小函1 岳轶云, 刘东宁, 于维先1,z

  1.吉林大学口腔医院牙周科长春130021;

  2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室长春130021

  [摘要] 荧光碳点是一种由碳构成的直径小于10 nm的新型纳米材料。凭借优良的荧光性能、生物相容性以及表面可功能化,拓宽了其在生物医学抗菌应用领域的潜力。近年来,荧光碳点在口腔医学领域备受学者关注。本文就荧光碳点的特性及其在细菌成像及抗菌领域应用的研究进展进行综述。

  [关键词]荧光碳点;生物学成像;抗菌

  [中图分类号] R 318.08 [文献标志码]A [doi] 10.7518/gjkq.2018.05.012

  Progress on the application of fluorescent carbon dots to bacterial imaging and antibiosis Meng Yang'. Wang Liuran', Tang Qiuling', Ding Xiaohani, Yue Yiyun', Liu Dongning', Yu Weixianl.2. (1. Dept. of Periodontology Ho.spital of

  Stomatology Jilin University, Changchun 130021, China; 2. Jilin Provincial Key LaboratoFy of Tooth Dewdopment and Bone Remodeling, Changchun 130021, China)

  This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81570983), Natural Science Foundation of the Jilin Provincial Science & Technology Department (20150101076JC) and Health & Technology Innovation Program ofthe  Jilin Province (2016J073).

  [Abstract] The fluorescent carbon dots is a new type ofnano material consisting of carbon. Their diameter is less than 10 nm.

  With their excellent fluorescence properties, biocompatibility and surface functionalization, the fluorescent carbon dots has potential for application to the biomedical and antibacterial fields. In recent years, the fluorescent carbon dots become the focus of research in the field of Stomatology. In this article, the characteristics of fluorescent carbon dots and their applications to bacterial imaging and antibacterial field are revieweds.

  [Key words] fluorescent carbon dots; biologicalimaging; antibiosis

  荧光碳点是Xu等[.]在2004年制备碳纳米管的过程中偶然发现的一种新型的碳纳米材料,其具有优良的光化学稳定性与小尺寸特性,同时还有良好的生物相容性、水溶性、特殊的电子性能和易于实现表面功能化等特点。目前,已有学者【z]对荧光碳点的抗菌性能进行研究。

  口腔中的微生物是以生物膜这一生态形式存在的,生物膜内的稳态平衡机制被打破时则会导致条件致病菌的感染。危害人类口腔健康的常见病龋病和牙周病是典型的生物膜疾病[3],其发生、发展与不同口腔病原菌的定植形成生物膜相关f 4】,如变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌等。目前临床上抗菌药物的应用是细菌性感染疾病的治疗方法之一[5]。然而,随着抗菌药物多药耐药性病原体的进化[6],一种新的替代抗菌战略就急需整装待发。因此,本文主要对荧光碳点的特性及其在细菌成像及抗菌领域应用的研究进展进行综述。

  荧光碳点及其生物学性质

  碳点( carbon dots)是一种零维半导体纳米晶体,其平均粒径小于10 nm,主要南sp3碳和sp2碳组成[7]。其结构多样,可分为无晶格结构的碳纳米粒和具明显品格结构的碳点。碳点的元素组成主要为碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)4种。经处理后的碳点sp2特征明显,表面上含有大量的羟基、羧基和氨基等官能团,O、H、N所占比例也相应增加,提高了碳点的反应活性。此外,荧光碳点合成原料丰富、廉价、易得,合成方法简捷、多样f 8]。目前为止,各种合成方法如碳化法、化学氧化法、水热法、电化学法、微波法和热解法等已用于制备碳点[7]。

  1.1荧光性能

  荧光碳点因其荧光性质在生物医学领域受到学者们的广泛关注。其作为一类新型的荧光标记材料,具有激发波长依赖性,随着激发波长的变化,荧光强度和荧光发射光谱也随之变化。其荧光发射波长跨度范围广,光吸收从紫外区逐渐衰减到可见光区,且一直延伸到近红外区,呈现出多元激发、多元发射的光谱特性。在近红外区发射的荧光有很强的组织穿透性,对细胞组织几乎无损伤,且无背景荧光。Singh等[,]将碳点生物活性有机硅纳米粒子(100 yL,2 mg.mL一.)注射到裸鼠皮下组织,在注射后3d可观察到鼠注射部位清楚地显示荧光信号。在裸鼠体内证实了光学成像,这表明碳点生物活性有机硅纳米粒子可作为体内成像医药制剂。

  1.2生物相容性

  相比于传统量子点,碳点由于其荧光性和低细胞毒性等特点被广泛应用于生物医学领域fto一I。为了研究中枢神经系统的传导特点,Li等[-:]将碳点及碳点缀合物注射入斑马鱼心脏,24 h后斑马鱼生命体征正常。为探明碳点的长期稳定性和衰减机制,Zhang等[13]采用微波辅助碳化法分别制备人毛发衍生碳点和猪皮肤衍生碳点,并配制成不同浓度与受精后4h的斑马鱼共培养,观察受精后120 h的胚胎死亡率,结果显示当人毛发衍生碳点和猪皮肤衍生碳点浓度分别低于0.8和1.6 mg.mL一·时,碳点对胚胎无明显影响。这些研究结果均显示碳点可作为一种安全有效的荧光标记材料,在细菌成像及抗菌领域具有良好的应用前景。

  2荧光碳点在细菌成像检测中的应用

  细菌感染是对人类健康的全球性挑战之一[14-15],疾病的快速诊断以及抗菌治疗的研究进展对临床治疗具有重要意义。特别是随着细菌抗菌药耐药性的增加[,s一.7],细菌感染检测和抗菌药应用的研究就更加迫切。目前常用的细菌检测方法包括通过细菌培养和以多聚酶链式反应( poly-merase chain reaction,PCR)为代表的分子生物学技术等方法检测细菌[1S]。其次,还可通过使用荧光染料(如碘化丙锭)或利用半导体量子点进行细菌成像鉴别,但大多具有准确性差、光稳定性差、细胞毒性大以及成本高等缺点,无法进行应用。因此,寻找一种新的有效的细菌检测和成像方法受到越来越多的关注。

  近年来研究发现荧光碳点由于具有良好的荧光成像功能、易于化学修饰、制备T艺简单和良好的生物相容性等优点,在细菌成像研究中表现出巨大的优势。Kasibabu等[¨】用无花果纯木瓜汁作为碳源,经一步水热法合成了一种发射峰在461 nm处量子产率为7%的荧光碳点。枯草芽孢杆菌和棘孢曲霉在与荧光碳点37℃孵育6h后,在不同的激发波长下,激光共聚焦显微图像显示分别发出绿色和红色的荧光。这表明荧光碳点可作为荧光探针成像细菌中的枯草芽孢杆菌和真菌中的曲霉,其可应用于细菌和真菌生物学成像且非常有价值。

  Nandi等[20]研究发现两亲性碳点(amphiphilic carbon dots)的烃链官能团与细菌细胞膜两性离子磷脂具有高亲和力,能结合到细菌细胞膜,增加细菌初始荧光,以达到最大可用结合位点。通过设置一定的荧光阈值,使细菌细胞及胞内细胞器彩色显微成像,从而利用荧光检测细菌细胞。碳点的荧光强度和光谱位置取决于细菌种类,因此在混合细菌种群的情况下,荧光碳点可作为区分细菌的一种工具。进一步可作为荧光探针标记细菌细胞分裂的“极点”,使其生理过程可视化。根据碳点的小尺寸性、表面易于修饰等特性,Hua等[21]以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或大肠埃希菌(Escherichia coli)作为碳源,通过一步水热法合成了金黄色葡萄球菌碳点或大肠埃希菌碳点。因其独特的表面官能团、小尺寸以及表面高负电荷,只穿过受损的细胞膜或细胞壁,导致选择性染色死亡的细菌或真菌,从而区分活的和死的微生物(细菌和真菌)其分别研究了革兰阳性菌和革兰阴性菌,当激发波长不同时,激光共聚焦显微镜显示死菌表现出蓝色、绿色和红色等不同的荧光颜色,从而实现检测活、死微生物。

  3荧光碳点的抗菌应用

  3.1荧光碳点的抗菌机制

  生物膜的基本成分是磷脂。生物膜的净电荷主要基于其磷脂的化学计量学和结构。例如,磷脂酰胆碱( phosphatidylcholine)和磷脂酰乙醇胺( phosphatidyl ethanolamine)通常没有净电荷;而磷脂酰甘油( phosphatidyl glycerol)、心磷脂( cardiolipin)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine)维持净负电荷。细胞膜中主要含的磷脂酰甘油、心磷脂和磷脂酰丝氨酸往往是高负电性,这些成分存在于许多病原菌中,复合成分决定细胞膜电荷性质。因此,在原核与真核细胞中存在细胞膜电化学梯度的差异。一般情况下,细菌细胞膜的负电性更强,其具有较高比例的阴离子(磷脂酰甘油和心磷脂)[22]。Koppelman等[23]研究表明,大肠埃希菌的细胞膜心磷脂含量比以前学者研究结果显示量更为丰富;而且出现磷脂酰甘油含量减少,同时心磷脂含量增加,从而保持这种细胞膜的高阴离子性。带正电荷的极性面帮助分子与生物膜结合,通过与带负电荷的头部基团的磷脂发挥静电相互作用,促进其抗菌活性[抖]。

  此外,脂多糖( lipopolysaccharide)和脂磷壁酸( lipoteichoicacid)分别是革兰阴性和革兰阳性菌细胞壁的主要成分,两者均带负电荷[弱]。革兰阴性菌的外膜上带负电荷的脂多糖可与带正电荷基团相互作用,从而破坏外膜结构。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分,且带有负电荷,可通过破坏肽聚糖结构或抑制其合成,损伤细胞壁,从而杀伤细菌。革兰阳性菌缺乏脂多糖,但其表面有肽聚糖存在。这一机制在研制荧光碳点时具有重要的指导意义,意味着荧光碳点本身或者可以通过在其表面功能化带正电荷,从而在抗菌应用研究领域发挥潜力。

  为了研究电压诱导细菌灭活,利用细菌表面结构所带负电荷,通过碳点本身带正电荷的极性面帮助分子结合细菌表面负电结构成分,诱导杀伤细菌。Feng等[26]将二氧化钛(Ti0.)纳米管阵列与碳点溶液共培养,获得光致发光碳点修饰的Ti0.纳米管阵列(C-dot-decorated Ti0.nanotu-bearrays,C-dot/TiNT)。其不仅具有光吸收能力,而且可通过电压引起的增强型细菌细胞膜电荷转移高效灭活细菌。在紫外光激发10 min内,C-dot/TiNT使一个几乎完整的金黄色葡萄球菌菌落和大肠埃希菌菌落灭活;而单独使用TiNT分别只有40%的金黄色葡萄球菌和51%的大肠埃希菌灭活。扫描电子显微镜图像也显示,电压诱导后灭活的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的形态发生变化。多阳离子电荷的多胺可以与细菌细胞膜相互作用,包括与细菌细胞膜表面的阴离子多糖和蛋白质的简单离子的相互作用[2 7J。Li等【28 J将柠檬酸铵热解制得亚精胺封端的荧光碳点( spermidine- capped fluorescent carbon quantum dots, SPD-CQD),其所带正电荷等可与细菌细胞膜卜.的多种蛋白质和多价肽聚糖通过氢键和静电相互作用,导致细菌细胞膜的破坏以及抑制细菌细胞膜的合成,从而达成协同作用。

  研究表明也可利用碳点的表面功能化,通过正电荷修饰后的碳点与细菌表面的带负电荷的结构成分等相互作用而诱导杀菌。对此,Bing等[29]合成了3种不同的表面电荷修饰的碳点,分别为带正电荷的精胺碳点( spermine C-dots)、带负电荷的蜡烛灰碳点( candle-soot C-dots)和不带电的葡萄糖碳点( glucose C-dots)。将大肠埃希菌与这3种碳点分别共培养12 h,进行活细菌计数,结果显示,葡萄糖碳点组细菌存活率为近100%,蜡烛灰碳点组和精胺碳点组细菌存活率分别为80%和15%。流式细胞术研究结果表明,当精胺碳点或蜡烛灰碳点与细菌相互作用时,产生的内源活性氧抑制细菌生长。同时,带正电荷的精胺碳点可以破坏细菌细胞膜,具有明显的杀菌效果[30-3l]。另外,为了研究碳点在细菌鉴别及抗菌领域的应用,Yang等[32]通过BS-12修饰制备季铵化碳点,利用BS-12阳离子积累渗透通过静电结合作用于革兰阳性菌细胞膜,提高季铵化碳点对革兰阳性菌的荧光成像性能。金黄色葡萄球菌与季铵化碳点孵育1 h后,在不同的激发波长下,碳点联合的细菌均能清晰显示不同的发光颜色。与此相反,大肠埃希菌在相同的条件下未表现出明显的荧光信号。

  3.2荧光碳点的抗菌作用

  在口腔医学领域中,牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的关键致病菌。为研究荧光碳点对牙龈卟啉单胞菌的抗菌作用,Liu等【粥]以甲硝唑为前体,通过一步水热法合成荧光碳点,研究其对牙龈卟啉单胞菌的选择性抗菌活性。将不同浓度的荧光碳点与牙龈卟啉单胞菌共培养24 h,测定细菌溶液的光密度值。结果显示1.25 Ug'mL一,荧光碳点能抑制71.7%的牙龈卟啉单胞菌生长,且随浓度增加,其抑制作用变得更强。说明荧光碳点在一定程度上对牙龈卟啉单胞菌具有抗菌活性。

  此外,荧光碳点可以作为载体可控性释放药物,在抗菌药物应用研究中也具有潜能。Thakur等[34]通过微波法以阿拉伯胶合成制备了荧光碳点,作为环丙沙星载体,结合率高于90%。药物释放曲线说明,该载药碳点可以持续释放药物超过24 h,且对具有代表性的2种革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和具有代表性的2种革兰阴性菌大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均显示了良好抗菌活性。因此,环丙沙星载药碳点在细菌性疾病治疗中具有潜在应用前景,也说明荧光碳点可作为控释药物抗菌活性研究发展的有效工具。

  4结论与展望

  综上所述,荧光碳点南于卓越的性能在细菌成像和抗菌应用等领域展现出巨大的潜力。口腔微环境是一个共生功能体,口腔正常菌丛之间以及它们与宿主之间相互依存,共同构成了动态平衡的几腔生态系。口腔疾病则破坏了这种平衡,其中变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌等关键致病菌在龋病和牙周病等常见口腔疾病的发生、发展中有重要作用,因此有效监测这些关键致病菌的水平,对龋病和牙周病诊断、治疗和预防等有重要意义。此外,能否通过碳点表面正电荷与细菌细胞表面负电结构相互作用诱导杀菌,控制感染,从而改变龋病和牙周病治疗的命运。目前,在n腔医学领域,荧光碳点在对口腔细菌的抗菌应用研究方面还处于起步阶段,Liu等[33]2017年初第一次研究荧光碳点对口腔内专性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌的抗菌作用,为荧光碳点针对口腔细菌的研究开辟了道路。尽管碳点的荧光量子产率、表面正电荷碳点的制备及其所带电荷量的安全性等问题仍需探索,但随着对于荧碳点的研究持续深入,在未来的口腔医学应用上,荧光碳点是应用前景十分光明的候选对象。

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