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碱性成纤维生长因子与血管内室大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生的作用机制

时间:2017-10-11 16:06来源:未知 作者:360论文网 点击:

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  碱性成纤维生长因子与血管内室大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生的作用机制

  金松+ 王瀚锐 刘彦东 范东旭 孙瑶 苏德旺 柯德志 汪宝林

  (佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯154007)

  【摘要】目的探讨联合应用血管内皮生长因子(VEGF)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生的作用机制。方法建立大鼠后肢动脉硬化闭塞模型60只,随机分为4组,生理盐水治疗组(NS组)15只,碱性成纤维细胞生长因子组(bFGF组)15只,血管内皮生长因子组(VEGF组)15只,血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子(VEGF+bFGF组)15只。NS组,VEGF组分别隔日一次腹腔注射生理盐水ImL. 100“g/LVEGF ImL;bFGF组隔日一次后肢股内侧多点肌肉注射100 u g/L bFGF ImL; VEGF+bFGF组隔日一次腹腔注射100“g/L LVEGF ImL+后肢股内侧多点肌肉注射100 u g/L bFGF ImL,共治疗21d。分别于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况如:间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等。继续饲养至3个月后取后肢股内侧部位肌肉组织行免疫组化观察血管数。结果VEGF+bFGF组微血管密度显著高于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性意义(P<0.05);其他各组间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与bFGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。结论VEGF联合bFGF能促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生,为临床治疗下肢动脉硬化闭塞提供新的治疗依据。

  【关键词】血管内皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子;下肢动脉硬化闭塞;血管再生

  Research ofBasic Fibroblast Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor in Rat Hind Legs Arteriosclerosis Occlusive Vascular Regeneration Mechanism

  JIN Song, WANG Han-rui, LIU Yan-dong, FAN Dong-xu, SUN Yao, SU De-wang, KE De-zhi, WANG Bao-Iin

  (the First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

  [Abstract]Objective To study combined with application of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on rat hind legs arteriosclerosis occlusive vascular regeneration mechanism of action. Methods Model rats hind limbs arteriosclerosis occlusive 60, randomly divided int0 4 groups with physiological saline treatment group (NS) 15, ofbasic fibroblast growth factor (bFGF) 15, 15 group vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor (VEGF + bFGF) 15. NS group, VEGF group respectively on a l mL celiac injection of saline, 100 yg/LVEGF l mL; BFGF group on a hind legs of the medial more muscle injection 100肛g!L bFGF f mL; Intraperitoneal injection of VEGF + bFGF group on a 100 yg/L LVEGF l mL + hind legs of the medial more muscle injection 100 yg/L bFGF l inL, 21 days of treatment. Respectively in 7 days, 14, 21 days observation rat hind limbs ischemia conditions such as: intermittent claudication, skin color change, skin temperature, foot ulcer. Continue to raise t0 3 months after taking hind limbs ofinside part muscle line immunohistochemical observations blood vessels. Results Microvascular density was significantly higher in VEGF + bFGF group than bFGF, VEGF and NS group, significant difference (P<0.05); There was no significant difference between each other significance (P>0.05). Visible VEGF and bFGF combination can promote hind legs arteriosclerosis occlusive vascular regeneration in rats. Conclusion VEGF joint bFGF can promote the rat hind legs arteriosclerosis occlusive vascular regeneration, for clinical treatment oflower limb arteriosclerosis occlusive treatment provides a new basis.

  [Key words] Vascular endothelial growth factor, Basic fibroblast growth factor; Lower limb arteriosclerosis occlusive; Vascular regeneration

  下肢动脉硬化闭塞症( arterial sclerosis occlusion,ASO)是由于动脉粥样硬化导致动脉狭窄、闭塞引起的下肢缺血性疾病,发病率最高的部位是股动脉,临床表现以患肢冷、麻、痛、间歇性破行、动脉搏动消失、肢体营养障碍、趾或足发生溃疡或坏疽为特点,给患者及其家庭带来了沉重的经济负担,且发病率逐年增加‘1]。随着现代医学的进步,许多新技术的开展为下肢动脉硬化闭塞的治疗开启了新篇章,但是各项技术均有其缺陷。Isnert等‘”提出了治疗性血管再生的概念,它的出现为这些患者的治疗带来了希望,致使许多国内外学者致力于其研究。本实验以大鼠后肢动脉硬化闭塞模型,研究VEGF和bFGF协同促进血管再生的作用机制。

  1材料与方法

  1.1研究对象

  购自大连医科大学动物实验中心SPF级雄性SD大鼠60只,3个月龄,体质量(280士30)g,随机分为4组,生理盐水治疗组(NS组)15只,碱性成纤维细胞生长因子组(bFGF组)15只,血管内皮生长因子组(VEGF组)15只,血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子(VEGF+bFGF组)15只。

  1.2主要试剂和仪器

  10%水合氯醛、4.0%甲醛,PBS液、VEGF、bFGF、一抗兔抗人vWF抗体,二抗生物素抗兔抗体,石蜡切片机、体式手术显微镜及显微手术器械、电子温度计、电生理压力测定仪,高速离心机、HE染色试剂盒等。

  1.3动物模型建立

  用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉,待大鼠麻醉后,用胶布将四肢固定手术台上。剪去后肢大腿及腹股沟部的毛,皮肤用强力碘消毒和酒精消毒,双侧腹股沟处取切口lcm,在体式显微镜下钝性分离包裹股静脉,股动脉和股神动脉鞘内,股动脉是淡红色的,在内侧,股静脉颜色略深,居中间,最外侧是股神经,利用显微操作系统结扎并切断股动脉各分支,将股动脉远端近a窝处连接电生理压力测定仪测其内压,在股动脉中下1/3处结扎使其内压降至原内压的1/5,查无出血点,缝合。

  1.4给药方式

  NS组、VEGF组分别隔日一次腹腔注射生理盐水ImL、100 u g/LVEGF ImL; bFGF组隔日一次后肢股内侧多点肌肉注射100肚g/LbFGF ImL* VEGF+bFGF组隔日一次腹腔注射100“g/L LVEGF ImL+后肢股内侧多点肌肉注射100“g/L bFGF ImL,共治疗21d。

  1.5观察项目

  于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况如:间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等。

  1.6实验取材

  饲养至3个月时将大鼠引颈处死,取后肢股内侧肌肉组织,4.0%甲醛固定。

  1.7组织切片及免疫组织化学检测

  在室温下以将用4%的甲醛浸泡24h后组织石蜡中,按横纹肌纵面切片,免疫组化标记一抗采用兔抗人vWF抗体(ab694:AbeamLtd,Cambridge,UK),二抗采用以生物素抗兔抗体,然后切片通过链霉菌抗生物素蛋白.过氧化物结合显色,细胞核行HE染色,同时进行阳性与阴性对照,切片放大22.5倍。

  1.8统计学方法

  数据及计算结果用均数士标准差(叉±s)表示,采用SPSS17.0统计软件处理数据,计量资料的两组间比较采用两样本f检验分析,以P< 0.05为差异具有统计学意义。

  2结果分析

  2.1于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况

  间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等,见表1—3。VEGF+bFGF组各情况显著低于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.01);bFGF组、VEGF组低于NS组,差异有统计学意义(P< 0.05);bFGF组、VEGF组之间差异无

  表1 7d大鼠后肢缺血情况观察指标

    组别 例数 间歇性跛行(只) 足溃疡(只) 皮肤颜色(只)
  有    无 有  无 变黑正常
    NS组     15     12    3     8    7     12     3
  bFGF组     15     10    5   4    11     10     5
  VEGF组     15     10    5     5    10   11   4
VEGF+bFGF组     15     9    6   2    13     4   11

  表2 14d大鼠后肢缺血情况观察指标

    间歇性跛行(只) 足溃疡(只) 皮肤颜色(只)
    组别
 
例数
 
 
  有    无
 
  有  无
 
 变黑  正常
    NS组   15   13    2   10    5     13     2
    bFGF组   15     8    7   4    1l     9     6
    VEGF组   15     9    6   5    10     8     7
VEGF+bFGF组     15     5    10     2    13     2     13

  表3 21d大鼠后肢缺血情况观察指标

    组别 例数 间歇性跛行(只) 足溃疡(只) 皮肤颜色(只)
  有    无   有  无  变黑  正常
    NS组   15   14    1   12    3     14    1
    bFGF组     15     6    9     3    12     4    1l
    VEGF组     15     7    8     4    11     3    12
 VEGF+bFGF组     15     2    13     1    14     1    14

  显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与bFGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。

  2.2电子温度计测量足部皮肤温度变化

  NS组平均(29.2±0.5)℃,bFGF组平均(30.6±0.3)℃,VEGF组平均(30.2±0.2)℃,VEGF+bFGF组平均(32.7±0.4)℃。VEGF+bFGF组显著高于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P< 0.01)}bFGF组、VEGF组高于NS组,差异有统计学意义(P< 0.05);bFGF组、VEGF组之间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与bFGF联合应用可改善后肢动脉硬化闭塞大鼠的血液循环。

  2.3侧支血管再生情况

  术后3个月缺血区肌肉组织内侧支血管再生计数,见图1~4。VEGF+bFGF组侧支血管再生显著高于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义∽< 0.01);bFGF组、VEGF组高于NS组,差异有统计学意义(P< 0.05);bFGF组、VEGF组之间差异无显著性意义∽> 0.05)。可见VEGF与bFGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。

  3讨论

  近年来,下肢动脉硬化闭塞的治疗主要包括手术治疗(动脉旁路转流术,大隐静脉旁路转流术、动静脉转流术∽等)、腔内介入治疗(包括经皮腔内血管成形术、支架置入术等)和非手术治疗(药物治疗),但均存在治疗后再闭塞的问题,目前未能得到很好的解决,尤其是远端血管无流出道、多节段、长段闭塞、严重狭窄、膝下小动脉的病变的患者,因无适合的人工血管而自体静脉材料又有限等原因,而非手术治疗所用的药物(抗血小板聚集、扩张血管、抗凝、溶栓、改善血流动力学等药物)效果均不理想。通过各种方法或手段促进缺血肢体新生血管生成和侧支循环的建立,可能是治疗此类患者有效的方法之一。Isnert等”1提出了治疗性血管再生的概念,它的提出为这类疾病的治疗带来了希望,在基因治疗和干细胞移植领域都呼应了此理论,基因治疗对严重肢体缺血患者的作用还在试验的初期,初步实验结果显示VEGF及bFGF可刺激新生血管的生成,但到目前为止还缺少大宗安慰剂对照、双盲、大样本病侧的临床研究。

  本实验采用建立大鼠后肢动脉硬化闭塞模型,采用安慰剂对照、双盲法证明了VEGF和bFGF联合应用能促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生见图1~4,VEGF+bFGF组侧支血管再生显著高于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.Ol)。由于VEGF和bFGF均为内皮细胞的有丝分裂原,体内和体外实验均证实有促进血管生长的作用。George[6]报道bFGF与vEGF有明显的时间和浓度关系,bFGF不但具有保护神经细胞的作用,而且能直接或间接地调节 VEGF的表达,增加内皮细胞的VEGF和bFGF在大鼠后肢动脉硬化闭塞引起的缺血区的表达增加趋势,促进血管内皮细胞分裂、毛细血管出芽生长,诱导蛋白溶解酶生成,增加内皮细胞出芽穿透基质的机率等功能,能特异性促进内皮细胞增殖”1,并提高血管通透性和改变细胞外基质,从而促进血管的增殖。缺血导致bFGF分泌且作用于缺血的血管壁,促进VEGF表达,同时又直接促进血管内皮细胞的增殖,起到与VEGF协同作用。

  总之,VEGF和bFGF联合应用能有效促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生,为临床治疗下肢动脉硬化闭塞提供新的治疗依据。

  参考文献

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