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双氢青蒿素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat增殖凋亡影响的研究

时间:2018-02-24 09:52来源:未知 作者:360期刊网 点击:

  双氢青蒿素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat增殖凋亡影响的研究

  惠海英 吴娜 弥鹏 孙晶莹 肖生祥

  (1.陕西省人民医院皮肤科;2.检验科;3.中心实验室;陕西西安7100684.西安交通大学第二医院皮肤科,陕西西安710004)

  摘要:目的探讨双氢青蒿素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat的增殖及凋亡的影响。方法研究对象为人皮肤鳞状细胞A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat,实验分为空白对照组、双氢青蒿素( dihydroartemisinin,DHA)组(20、40、60、80 Umol/L)。各组细胞药物干预24、48、72 h后进行检测,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞增殖能力;流式细胞(FCM)实验检测细胞凋亡。结果DHA以时间和剂量依赖性的方式抑制A431和HaCaT细胞增殖。不同浓度的DHA刺激细胞后24、48、72 h,与对照组相比,A431细胞生长抑制率明显降低,并在80 ymol/L DHA刺激72 h时达到峰值。HaCaT细胞中得到了相似的结果,但生长抑制率降低的没有A431细胞那么明显。A431细胞和HaCaT细胞预处理后用60 timol/L DHA刺激48 h,与对照组比较,测定细胞中,A431细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),同时对HaCaT细胞无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论DHA可抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖及促进凋亡,而且对正常细胞影响较小。

  关键词 双氢青蒿素; A431细胞; Hacat细胞; 凋亡

  Effects of Dihydroartemisinin(DHA) regulation of squamous cell carcmomaA431 cells and Hacat cells proliferation and apoptosis

  Hui Haiying' , Wu Nal ,Mi Peng2 , Sun J ingying3 , Xiao Shengxiang4. 1. Department o f dermatology,

  Shanri Provincial People's Hospital ,Xian 710068 ,Shanxi,China. 2. Department o f Clinical Laboratory,ShanriProvincial People's Hospital ,X ian 710068 ,China. 3. Central Laboratory ,Shaanxi Provincial People's Hospital ,Xian 710068 ,Shanxi,China. 4. Department o f Dermatology,the Second A f filiated Hospital o f Xian J iaotongUniversity ,Xian 710004 ,Shanxi,China.

  Abstract Objective To investigate the effects of Dihydroartemisinin(DHA) regulation of squamous cell carcino-ma A431 cells and Hacat cells proliferation and apoptosis. Methods The research objects were the human squamouscell carcinoma A431 cells and Hacat cells. The experiment was divided into four groups which were blank controlgroup and DHA experiment group( 20 ,40 ,60 ,80 timol/L). Four methyl thiazolyl tetrazolium ( MTT) assay was usedto observe the cell proliferative capacity,flow cytometry (FCM) test were used to detect cell apoptosis. Results DHAinhibited the proliferation of both A431 and Hacat cells in a concentration-dependent manner,compared with HacatA431 cells,A431 cells showed more pronounced growth suppression. After stimulation with different concentrationsof DHA for 24,48,and 72 h,an obvious decrease in the A431 cell growth inhibition rate was observed. Comparedwith the control groups and reached a peak on stimulation with 80 ymol/L DHA for 72 h. Similar results were ob-tained in Hacat cells,but with a much lower growth inhibition rate. The apoptosis of A431 and Hacat cells was meas-ured by FCM after preconditioning with 60pmol/L DHA for 48h. Results showed that in parallel with the controlgroups,there was a significant increase in apoptosis of A431 cells; DHA pretreatment induced an increase in theA431 cell apoptosis(PO. 05). Conclusion These results indicatedthat DHA may promote cellular apoptosis in SCC,with little influence on normal cells.

  KeywordsHydroartemisinin; A431 cells ; Hacat cell; Apoptosis

  中图分类号:R34;R739.5 文献标识码:A 文章编号:1000-744X(2017)09-0899-03

  皮肤癌是最常见的癌症之一,在世界范围内发病率逐年增加口]。鳞状细胞癌起源于表皮或附件的基金项目:陕西省中医药管理局(20151c039),陕西省社会发展角化细胞,是第二常见的皮肤癌,其发病率为20%。课题组将双氢青蒿素作为干预因素,研究其对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat的影响,通过检测双氢青蒿素对两种细胞生长抑制及细胞凋亡的影响,探讨其作用机制,以期为皮肤鳞癌的治疗提供一条新思路。

  1.材料与方法

  1.1材料细胞:皮肤鳞癌A431细胞株及永生化角质形成细胞株HaCaT细胞为第四军医大学西京医院皮肤科李承新教授馈赠。药物:二氢青蒿素购于西安吴轩生物技术有限公司,纯度98%。试剂:改良的DMEM培养基、RPMI 1640、胰蛋白酶、胎牛血清均为美国Gibco公司产品,噻唑兰(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国sigma公司。AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。仪器:流式细胞仪( BD-FACScalibur)二氧化碳培养箱( HEAL FORE90)、酶标仪(Bio- Tek公司)、紫外分光光度仪购自日本岛津公司。

  1.2方法(1) Hacat细胞:接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI1640培养液中,于37℃、5% C02的培养箱中培养,80%汇合后胰蛋白酶消化法传代培养,于传代后第2天换液。取对数生长期细胞制成4×104单细胞悬液,接种于6孔板后继续培养24 h给药。(2)A431细胞:细胞株常规方法复苏后,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM的低糖培养基,置5% C02培养箱(37℃,相对湿度95%)培养,2~3 d传代1次,取对数生长期细胞制成4×104单细胞悬液,接种于6孑L板后继续培养24 h给药。(3)药物处理:双氢青蒿素以二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为10-i mol/L储存液(DMSO浓度≤1%),- 20℃避光保存,用时用DMEM或RPMI 1640培养液将二氢青蒿素稀释配成O(对照组)、20、40、60、80 vmol/L的工作液,加入药物工作液后,细胞继续培养不同时间,进行后续实验。(4)HaCaT细胞及A431细胞细胞形态学观察:将HaCaT细胞及A431细胞及消化后调整细胞密度为4.0×l04 /mL,以每孔1 mI。接种于6孑L细胞培养板中培养,待细胞贴壁生长约24 h,细胞融合至60%~70%时,弃原培养液,分别加’入含双氢青蒿素O、20、40、60、80 FLmol/L的培养液2 mL,培养24h,倒置显微镜下观察细胞形态变化。(5)MTT法检测HaCaT细胞及A431细胞增殖抑制率:取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化,调整细胞数为4.0×l04 /niI。,以每孔100uI。接种于96孔培养板,培养24h后去原培养液进行实验。实验分为空白对照组(正常培养液)、实验组(含20、40、60、80 timol/L双氢青蒿素的培养液),各100 uL,每个浓度设3个复孔,于37℃、5% C02条件下培养。培养结束前4h,每孔加入MTT(5 ng/mL) 20 uL。培养结束时,弃上清,加入DMS0 150 uI。,振荡10 min,使结晶物充分溶解,用酶标仪分别测定培养24、48、72 h吸光度(A570值),细胞抑制率一(1-实验组平均A值/空白对照组平均A值)×100%。(6)流式细胞仪An-nexin V/PI检测A431细胞及HaCaT细胞早期及中晚期总凋亡率:取对数生长期Hacat细胞及A431细胞,以4×l04 /rriI。浓度接种于6孔培养板中,贴壁后加入浓度60 tjmol/L DHA工作液培养48 h后,经0.25% Trypsin-EDTA消化,200g离心6min,培养液弃去,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,收集的细胞经70%的乙醇4℃固定2h,14 000 g离心2min,固定液弃去,PBS缓冲液(含5mmol/L ED-TA) 500 VL进行细胞重悬,再经RNA酶室温孵育30min,以1×binding buffer制成单细胞悬液,置于流式管,每组设6个样,加Annexin V-FITC10uL与PI 5uL,混匀后室温下避光孵育15 min,再加入1×binding buffer充分混合后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

  1.3 统计学方法 采用统计软件SPSS18.0对实验数据进行分析,计量资料数据以(z±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用£检验。计数资料以率表示,采用xz检验,以P有统计学意义。

  2.结果

  2.1 光镜下Hacat细胞及A431肿瘤细胞的形态观察:Hacat细胞和A431细胞在没有经过DNA处理前生长旺盛,折光率较高,胞体大,形态成梭形或多边形,胞质均匀透明。经过DHA处理后两种细胞增殖减慢,且随着DHA浓度的升高和作用时间的延长,细胞逐渐变小、变圆,折光率减弱,核浓缩等,部分脱落漂浮于培养瓶中,但细胞膜完整,最后裂解。DHA浓度越高,作用时间越长,上述表现越明显,漂浮细胞越多。但与Hacat细胞相比,A431细胞增殖更慢,漂浮细胞更多。

  2.2 二氢青蒿素对Hacat细胞及A431肿瘤细胞增殖活力的影响 不同浓度的DHA刺激细胞后24、48、72 h,与对照组相比,HaCaT细胞和A431细胞生长抑制率均有增加,但以A431细胞最为明显,并在80FLmol/L DHA刺激72 h时达到峰值。而且DHA处理后,与HaCaT细胞比较,A431细胞的生长抑制率与浓度在各个时间点显著增加。这些结果表明,DHA以时间和剂量依赖的方式显著抑制A431细胞增殖,但对正常角质形成细胞的影响较小。

  2.3 二氢青蒿素对Hacat细胞及A431肿瘤细胞凋亡的影响 A431细胞和HaCaT细胞预处理后用60ymol/L DHA刺激48h。结果表明,与对照组比较,A431细胞凋亡显著增加(P<0.05)同时对HaCaT细胞无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。这些结果表明,DHA可促进scc肿瘤细胞凋亡,对正常细胞影响较小。

  3.讨论

  皮肤癌是最常见的癌症,在世界范周内,据世界卫生组织估计,每年全世界大约有46 000人因此死亡。鳞状细胞癌是一种常见的的恶性肿瘤,可能出现在许多部位,包括皮肤、口腔、眼部上皮,咽喉,消化道和支气管上皮细胞。鳞状细胞癌不仅可以导致病人外观的变化,也容易转移到淋巴结和内脏。因此,迫切需要开发更有效的治疗鳞状细胞癌的药物及方法。

  近年来,草药和天然产物被证明是非常合适的抗癌药物的来源。青蒿素是从植物蒿青蒿中分离的天然产物,是一种应用广泛的抗疟药。DHA是青蒿素的一种衍生物。最近,越来越多的证据说明,青蒿素衍生品包括DHA有选择性的细胞毒性作用,在多种人类癌症细胞包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和肝癌中有强大的抗癌作用。 .

  在这项研究中,我们研究了DHA对人鳞状细胞癌A431细胞和人正常细胞Hacat细胞的影响。发现,DHA以时间和剂量依赖的方式抑制A431细胞增殖。我们进一步分析了DHA诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测表明,DHA可以增强在A431细胞凋亡,但对正常角质形成细胞的影响较小。以上结果表明,DHA可抑制A431细胞增殖,促进凋亡,这意味着DHA具有潜在的抗癌活性。

  参考文献

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