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实时荧光PCR技术在手足口病实验诊断中的应用探讨

时间:2016-10-27 09:44来源:未知 作者:360期刊网 点击:

  实时荧光PCR技术在手足口病实验诊断中的应用探讨

  陈桂华

  (武汉市新洲区汪集街中心卫生院 武汉 430000)

  摘要:目的;研究分析实时荧光PCR技术在手足口病实验诊断中的应用价值。方法:针对本院2013年5月至2016年1月收治的疑似手足口病患儿378例进行研究分析,并采集粪便标本,进一步针对肠道病毒通用型以及CA-16(柯萨奇病毒16型)和EV- 71(肠道病毒71型)进行鉴别诊断和分析。结果:本次研究收集的378份粪便标本经过实时荧光PCR检测采用通用型试剂盒阳性检出例数为319份(阳性检出率为84.39%)。,其中有58例患儿是EV- 71感染(占18 .18%),CA-16感染患儿有132例(占41.38%)。结论:调查分析发现,CA-16和EV- 71肠道病毒是导致手足口病发生的主要病原体,并且本地区以CA-16占主导。实时荧光PCR技术用于手足口痛实验诊断具有重要的应用价值。

  关键词:手足口病 实时荧光PCR肠道病毒CA-16诊断价值

  手足口病是肠道病毒感染导致的急性传染病,本病好发于夏季和秋季,本病具有较强的传染性,并且该病的传染途径较复杂,主要发生于年龄在5岁以下人群。导致手足口病发生的常见病原体有柯萨奇病毒16以及肠道病毒71型两种,后者还可导致脑炎、无菌性脑膜炎以及脑脊髓炎等疾病,甚至还可能导致患者死亡口3。本病早期快速检验和诊断对于疾病后期的治疗和临床预后均具有重要的意义。本研究小组为进一步研究实时荧光PCR技术在手足口病实验诊断中的应用价值。特进行如下研究:

  1资料与方法

  1.1 一般资料。针对本院2013年5月至2016年1月收治的疑似手足口病患儿378例进行研究分析,其中包括男192例,女186例,年龄在1个月-14岁不等,平均年龄(1.65±0.32)岁。共采集粪便标本378份。仪器采用中山大学安达基因股份有限公司生产的肠道病毒荧光PCR定性试剂,主要包括EV、EV - 71以及CA - 16三种。并采用美国MX3000P实时荧光定量PCR仪进行标本的检测。

  1.2方法。首先提取肠道病毒DNA,采用生理盐水对粪便标本进行重悬,并取适量放入1.5 ml灭菌离心管,并加入200ul Trizol试剂和100ul氯仿,分别加入100ul粪便重悬液以及阴性质控品和阳性质控品,震荡20s后静置3min。采用冷冻离心机,转速为12000r/min,离心时间为2 min,并将上清清液转移至另外一只1.5ml灭菌离心管,加10ul RNA提取液A,并充分震荡摇匀,离心Imin(8000r/min),弃去上层清液,加入溶液C 400ul,使用前应震荡摇匀,并冷冻离心Imin,弃去上层清液,通风沉淀15 min后加DEPC 30ul,混匀后(白色悬浊液),待用PCR扩增(取适量PCR反应管,分别加入逆转录酶2ul以及TaP酶系3ul和相应的RT- PCR反应液15ul,并向各管内加入处理过的阳性控制和阴性控制品以及样本RNA悬浊液5ul,然后离心,将PCR反应管放入实时荧光PCR仪)。

  1.3结果判定。①阴性:检验标本未见典型的S型的曲线,或者Ct>35则为阴性;②阳性:检验标本中存在典型的S型曲线,并且Ct≤35即为阳性‘2]。

  1.4统计学分析处理。应用统计学软件SPSS18.O对本次研究所得数据进行统计学分析处理;计量资料用(X土S)表示;计数资料用X2检验,用(n,%)表示f P<0.05表示差异有统计学意义。

  2结果

  本组研究对象粪便标本检测结果分析。本次研究收集的378份粪便标本经过实时荧光PCR检测采用通用型试剂盒阳性检出例数为319份(阳性检出率为84.39%),其中有EV和CA-16均为阳性123例;EV和EV- 71均为阳性57例,比较差异具有显著性(P例患儿是EV- 71感染(占18 .18%),CA-16感染患儿有132例(占41.38%)。

  3讨论

  手足口病是临床中常见的一种好发于儿童的传染性疾病,主要病原体有CA-16和EV- 71,并且感染后者的患者的临床症状较为严重,少数患儿甚至出现一系列中枢神经系统以及呼吸系统和循环系统症状,甚至死亡,已经引起社会的高度关注。本病具有一定的防控性,早期诊断并实施隔离和具体化治疗,能有效控制疾病的传播,同时还能提高临床治愈率‘3]。

  目前临床主要通过临床表现予以诊断,传统的实验室诊断方法包括病毒分离以及中和试验和ELISA,其中病毒分离手足口病临床诊断的金标准,但进行病毒分离需要的时间较长,并且对于操作的要求较高,同时需要特殊的设备,操作繁琐,因此一般不用于早期诊断。而实时荧光PCR技术对于本病的早期诊断具有较高应用价值,并且操作相对简单,稳定性和重现性相对较好。通过本次研究结果发现,实时荧光PCR技术对于手足口病检验,对于肠道致病菌中的CA -16和EV- 71两种类型较为敏感,而这两种病原体也是手足口病常见的病原体,由此可见,实时荧光PCR技术可以作为手足口病的早期诊断方法H3。

  参考文献

  [1] 余雄武,冯琳,潘虹等,实时荧光RT - PCR法检测手足口病病原体EV71和CA16及临床特点分析[J].中国妇幼保健,2016,31(2):408- 410

  [2]张群,杨蕾,曹伟峰等,实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体[J].检验医学,2012,27(5):416-418

  [3]王七生,秦金勇,蒋立立等,实时荧光PCR技术在手足口病原学检查中的应用[J].中国医药导报,2011,08(17):90-91

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