调度自动化论文:
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摘 要：目的：改良成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用NPP底物法、125I标记放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、SDS－PAGE还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原。 结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中AKP分泌量为(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量为(1.875±0.549) ng/ml，明显高于成纤维细胞(P＜0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时避免成纤维细胞混入。
关键词：成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 胶原
成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(OCN)、大量碱性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型胶原’而无Ⅲ型胶原分泌［1］。我们采用改良骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后’再用胰蛋白酶消化’加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实’获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。
材料与方法
一、液体的配制
0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液，抽滤灭菌。培养液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL’Grand Island’NY)’加20%灭活新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25 cm2培养瓶(NUNCLON’Denmark)。
二、骨组织片消化
取骨科手术中获得的无菌骨碎片’彻底去除骨膜及软组织；用无菌Hank′s液冲洗3次’剪碎至体积小于1mm3；Hank′s液多次冲洗至骨片发白’放入锥形瓶内’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积)’37℃水浴中消化(30 min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中’置37℃ CO2培养箱内2～3 d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30 min’上清液经尼龙网过滤后’离心10 min(1000 r/min)’去掉上清液’沉淀物用培养液打匀’接种于25 cm2培养瓶内’重复3次’直至离心后无沉淀物为止。
将消化后的骨片浸泡于培养液中’2～3 d后’重复上述胰蛋白酶消化步骤’仍有细胞释放’根据所需细胞量’可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊’10 h后即有贴壁细胞’72 h后’细胞完全贴壁’可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×105/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4 ml’5 d后换低血清培养液6 ml，24 h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存’用于检测。
三、成骨细胞特征性鉴定
以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。
1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素’使终浓度为50 μg/ml’培养箱内培养1 h’换新鲜培养液培养1 h，经Hank′s液冲洗3次’乙醇梯度脱水’固定’Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。
2.成骨细胞上清液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt’NPP’上海丽珠东风公司)比色法［2］’无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol’经405 nm波长比色’测得OD值’换算成国际单位。
3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测［3］。根据放射免疫竞争结合原理，125I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品OCN含量。
4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提［4］，SDS-PAGE垂直板还原电泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽［5］。电泳液为0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；样品液为0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10% HAC；脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后’放55℃水浴中变性1 h’加入样品缓冲液50 μl’每个样品点2孔’每孔加样20 μl’另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品’50 mA恒定电流电泳1 h后’每个样品第1孔内加入100 μl 20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)样品缓冲液’静置1 h后’13 mA恒定电流电泳12 h’染色液染色1 h’脱色液脱色24 h’拍照片。
讨 论
一、成骨细胞体外培养方法的建立
早在20世纪60年代’Peck和Birge［8］开始用胶原酶消化骨片’体外培养成骨细胞获得成功；1975年’Wong等［9］采用多次胶原酶消化’使培养的成骨细胞得到纯化。1985年’Robey和Termin等［10］采用低Ca2+培养液培养骨片获得成骨细胞’经过鉴定’比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改良上述方法’先使用比胶原酶更便宜的胰蛋白酶进行多次消化’胰蛋白酶仅能消化骨小梁表面细胞周围的基质，而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞，因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，无细胞释放，证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞，而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后，静止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接［11］’感知外界溶液浓度变化’特别是钙离子浓度变化［10］’开始活跃起来’通过骨细胞性溶骨作用［12］释放出来’在骨片周围形成贴壁细胞’但一般要经过2周以上时间’且贴壁细胞仅出现于骨片周围［10］’数量有限。在骨细胞释放出来以前’再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量’既代替了胶原酶的作用’又可避免成纤维细胞的混入。消化细胞接种后，经2～3周培养可达汇合’取第2、3代细胞检测，可避免长期培养，反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示，此方法简单、实用，并可获得足够数量的成骨细胞。
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