骨质疏松症与中医医籍中;骨痿”、;骨枯”、;骨痹”描述的特征,如:腰背酸痛、身长缩短、驼背、骨折极为相似。随着现代医学的不断进步,骨质疏松症的研究已进入分子生物学水平。Morrison等[。 首先证实维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因多态性与骨密度之间存在较强的关联,并认为VDR 基因多态性可占骨密度总遗传因素的75%左右,此后越来越多的绝经后骨质疏松症易感基因,如:雌激素受体(estrogen receptor,ER)[2、VDR、骨钙素 (osteocalcin,OC)基因被报道。

  近年中医证的研究认为,先天禀赋的差异,后天环境、社会因素的影响,使不同个体表现不同的证的特点。证与先天因素之间的研究渐成热点。本文试图通过研究绝经后骨质疏松症(postmenopausa|OSteoporosis。POP)患者中医证型与OC、ER基因多态性的关系,分析绝经期后骨质疏松症中医证的遗传易感性,为临床的诊治提供帮助。

  1 材料和方法1.1 研究对象从福州地区常住汉族人口中随机筛选绝经后妇女632例,严格按照临床试验机构伦理委员会操作规程,根据纳入标准及排除标准.后纳入592例。患者均为自然绝经1年以上者,年龄在48~73岁;平均年龄(60.2±3.5)岁。1.2 主要试剂和仪器双能X射线骨密度仪(0STEOCORE型, 法国Medilink公司):PCR仪(PTC一200型,美国伯乐MJ research);血液基因组DNA抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]:Taq DNA聚合酶、dNTP、10~PCR缓冲液(北京华美生物工程公司);限制性内切酶Hindm[宝生物工程(大连)有限公司],OC引物(上海生工生物工程有限公司)序列为:P1:5’一CCGCAGCTCC.CAACCACAATAAGCT一3’:P2:5’一CAATAGGGCGAGGAGT一3 ]。雌激素受体o【基因Xba I多态性检钡4弓I物P1:5’一CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC 一3’:P2:5’ 一TCTTTCTCTGC.CACCCTGGCGTCGATlrATCTGA一3’[2 3。

  1。3 中医辨证标准 参考全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会1986年制定的《中医虚证辨证参考标准》 对骨质疏松症进行中医辨证分型,分为肾阴虚、 肾阳虚以及非肾虚3个证型。

  1.4 纳入标准① 年龄48~73岁的女性,自然绝经时间大于1年以上;② 符合中国人骨质疏松症建议诊断标准 ;③ 受试者知情同意。

  1.5 排除标准① 患可引起继发性骨质疏松症的内分泌疾病者(如:甲亢、甲旁亢、甲状腺囊肿、柯兴氏病、糖尿病等);② 子宫或卵巢切除病史者;③ 测试前3个月内使用过雌激素、糖皮质激素、降钙素等于扰骨代谢的药品者。

  1.6 骨密度检测 采用双能X射线骨密度仪检测正位腰椎(L24)、左侧股骨颈、大转子和Ward’

  S三角区的骨密度(g/cm ),精密度:<1% ;记录年龄(岁)、绝经年龄(岁)和绝经年限(年)。

  1.7 OC基因HindⅢ 多态性检测 静脉取血,ACD抗凝.用血液基因组DNA抽提试剂盒从血液中自细胞提取基因组DNA。PCR(polymerase chainreaction)扩增后,扩增产物经Hind m酶切,置于3.8%聚丙烯酰胺中凝胶电泳。基因型判断:HH型(253 bp),hh型(232,21 bp),Hh型(253、232,2lbp)。

  1.8 ER基因Xba I多态性检测 聚合酶链反应扩增反应结束后.扩增产物经Xbal酶切后,进行琼脂糖电泳,EB染色。基因型判断:XX型(1300bp),Xx型(1300,900,400 bp),XX型(900,400 bp)

  1.9 统计学处理应用SAS 8.2软件进行分析,基因型分布频率比较采用卡方检验.P<0.05具有统计学意义。

  2 结 果

  2.1 辨证分型592例绝经后女性中,骨质疏松症患者为371例,占62.7% ,正常对照组221例,占37.3%。在骨质疏松症患者中,肾虚证283例,占骨质疏松患者的76.1% ,非肾虚88例,占23.9% 。

  在肾虚中,肾阴虚61例,占肾虚证的21.6% :肾阳虚58例。占20.5%。

  2.2 各组OC基因Hind II1基因型分布频率见表1。基因型分布均符合Hardy~Weinberg遗传平衡定律(肾阴虚组卡方=O.17,P>0.05:肾阳虚组卡方=2.08,P>0.05;非肾虚组卡方=0,P>0.05;对照组卡方=0.88.P>0.05),说明各组都具有群体代表性。分别与对照组、肾阴虚组相比,肾阳虚组在0C基因Hind HI基因型分布频率具有显着性差异(P<0.05).表明该多态性位点可能与绝经后骨质疏松症肾阳虚证相关;与非肾虚组比较,无统计学差异。

  2.3 各组ER基因Xba I基 型分布频率。基因型分布符合HardyWeinberg遗传平衡定律(肾阴虚组卡方=0,P>0.05;肾阳虚组卡方=0,P>0.05:非肾虚组卡方=0,P>0.05;对照组卡方=0,P>0.05),说明具有群体代表性。与对照组相比,肾阳虚组在ER基因Xba I基因型分布频率具有显着性差异(P<0.01),表明该多态性位点可能与绝经后骨质疏松症肾阳虚证相关;与其他组相比,均无统计学差异。

  3 讨 论

  不同个体在对疾病的易感性上是有差别的.不同的个体患同一种疾病时.所表现的证也具有个体差异性。;证”是对疾病发生过程中不同阶段病因病机的高度概括,同一证有共同的临床表现和病理机制,说明其可能有共同的物质基础,而这种物质基础在现代科学看来,就很有可能反映在基因组或基因水平上。

  目前,中医辨证分型与基因多态性的研究是中医辨证论治研究的热点,从遗传基因多态性分析中医辨证分型,力图探讨中医;证”的本质。安胜军等对246名中国绝经后女性用RFLP法分析内切酶PvuⅡ 、Xba I限制性长度片段多态性,将研究对象分为肾阴虚型、肾阳虚型和阴阳俱虚型.结果表明:PPxx基因型骨密度明显偏低,该基因型女性在中医辨证属阴阳俱虚型,雌激素受体基因RFLP与中医辨证分型有关。葛继荣等的研究显示,在维生素D受体基因bb型中,肾阴阳两虚患者第2~4腰椎骨密度明显低于肾阴虚型.其他证型之间差异不明显;但张华等的研究显示,VDR Bsm基因型与中医证型之间尚未发现明显的相关性本研究结果表明,与正常对照组相比.肾阳虚证在不同0C基因[1indllI基因型、ER基因Xba I基因型中分布有显着性差异(P<0.05)。绝经后妇女骨质疏松症中医证可凶遗传基因多态性而表现出证型分布的差异现象,提示骨质疏松症易感基凶多态性对中医证的分布具有一定影响。

  开展证与基因多态性的相关性研究,从同一疾病不同证和同一证不同疾病的基因多态性差异比较中,寻找证的共同性和差异性.从而揭示证的科学内涵,为证的实质研究提供可能的突破口,从而进一步丰富和发展中医学理论。