血小板微颗粒(PMP)是血小板在激活状态下或凋亡时细胞膜伸展变形以出芽方式形成的微小囊泡,且通过其表面磷脂质(PS)和组织因子的表达在体内起到促凝血作用。循环中PMP的含量反映了血小板的活化程度并独立参与了血栓形成及进展过程。血小板的激活和PMP的释放是急性冠脉综合征(ACS)的关键步骤。本文就PMP的产生机制、生物学特性、定量检测及其在ACS中的研究进展作一综述。

  1 PMP的来源和产生机制微颗粒是由细胞起源、数量、大小、抗原成分和功能特性各不相同的一群细胞组成的,主要来源于激活的血小板,也可以由白细胞、淋巴细胞、红细胞和上皮细胞产生。在健康人循环中的PMP含量很少,但在高凝状态下如弥漫性血管内凝血(DIC)、ACS、下肢血管疾患(PAD)、糖尿病和全身性炎症疾病等情况下其含量明显升高 ]。

  目前研究发现,高切应力和多种激活剂作用于血小板均可引起血小板活化并释放PMP。一般非生理性激活剂如离子载体效能强,而在生理状态下几种激活剂的效能排序为:C5b一9膜攻击复合物>凝血酶和胶原>凝血酶>胶原>ADP和肾上腺素。这一排序以PS依赖性促凝血活性为基础,利用膜联蛋白V和PS的结合检测,在未经刺激的乏血小板血浆中,80 的PMP不能与膜联蛋白V结合,故这一排序实际反映了膜联蛋白V阳性的PMP亚群的比例。Connor等D 的实验表明,外源性膜联蛋白V可以抑制达95 的PS的活性,提示膜联蛋白V可真实反映PMP的促凝血能力。血小板活化的标志物CD62、CD63P在膜联蛋白V阳性者显着高于阴性者,CD42b则明显降低,进一步提示了膜联蛋白V与促凝血能力的相关性。此外,不同亚群的组织穿透能力不同,这些异质性的产生机制值得进一步探讨。

  早期凋亡的血小板也可以通过细胞膜骨架重构和出芽方式产生PMP,这一途径独立于血小板的激活,而与Bak/Bax-caspase通路有关,故不受血小板活化抑制剂和细胞外钙螯合剂的影响,但Bak/Bax基因敲除或其抑制剂却能严重阻断该通路。

  高切应力或激活剂作用于血小板的不同受体,经历共同的关键步骤:Ca 入胞、细胞骨架重构、calpain活化和线粒体的去极化_5],终导致细胞外形改变、出芽产生PMP。因此,PMP产生的不同通路有各自的调节机制 j。高切应力作用下产生的微颗粒形成过程中,CD42b发挥极为重要的作用:当CD42b与细胞骨架之问的联系断裂,不稳定的血小板膜在高切应力作用下形成了PMP。而在激动剂诱导通路中,激动剂首先作用于糖蛋白(Gp)Vl,之后通过cD41/cD61复合物的作用引起Ca 内流,Dale等_7 的研究表明,血小板表面的跨膜蛋白CD9也可能与该复合物一起参与了这一通路。糖蛋白Ⅵ 激活后的下游通路与c型凝集素受体CLEC一2相同。

  虽然是否是CLEC一2的激活导致PMP的产生尚未可知,然而,CLEC一2的天然配体是表达在肿瘤细胞上的平足蛋白(podoplanin),并且循环中PMP水平的升高与肿瘤转移有关。

  激活的血小板还可以产生另外一种微粒叫做外来体(exosomes),来源于血小板内多泡体(muhivesicular bodies)的胞吐作用。这种外来体直径在4O~100nm,因此一般不能被流式细胞仪检测到。Exosomes不表达血小板表面标志物如Gp工b、Gp1I b、GpⅢa等,PS的表达量也很低而几乎无促凝血活性,但其表面交联蛋白CD37和CD63的表达提示其在信号传导和细胞黏附中的可能作用。

  此外,exosomes通过诱导凋亡引起的心肌抑制作用也值得进一步探讨。

  2 PMP的生物学功能

  2.1 促凝血功能PMP促凝血功能源于它表面可以表达磷脂酰丝氨酸(PS),并提供促凝表面。在PMP的形成过程中,膜不对称性的失去导致PS从膜内层迁移至外层 。带负电荷的PS通过静电及疏水作用促进凝血因子F VI a、VI、Ⅸ 和X在其表面的结合,在Ca 的参与下,FVII a结合FⅨ 、FX形成X一酶复合物,促进FX的活化,进而形成凝血酶原复合物使凝血酶原转变为凝血酶。Van Der Meijden等的研究表明,PMP还可以通过FⅫa通路启动凝血过程,但这一途径在凝血瀑布中的比重还需要进一步探讨。虽然Ⅷ因子连接血小板是不稳定的,但Ⅷ 因子和V a因子可稳定地结合于PMP的表面,因此PMP可以不依赖血小板的激活而促进凝血,且这种促凝血活性比血小板激活所致的凝血能够持续更长的时间。此外,PMP表面PS的密度是活化血小板表面PS密度的3倍,考虑到两者表面积的差异,这提示PMP的促凝血活性约为活化血小板的50~100倍。PMP的促凝血作用在Castaman综合征和Scott S综合征中进一步得到证实:PMP的产生缺陷导致出血倾向的发生。

  2.2 参与免疫反应PMP可以通过增加受体细胞表面粘附分子的表达,并刺激细胞因子的释放来参与机体的免疫反应:它通过CD40L来刺激抗原特异性IgG的产生,并与CD4 T细胞协同调节生发中心的功能 引。此外,它还可以调节IgG粒细胞的聚集和巨噬细胞的吞噬作用。在真菌引起的败血症中PMP数量及表面粘附分子的表达显着增加,提示其在机体防御反应中的作用,并为通过对PMP的检测来进行败血症传染源的早期诊断提供了可能。

  2.3 传递生物信息PMP既可以通过直接作用于表面配体来激活靶细胞,也可以通过自身的黏附作用,将生物活性物质在靶细胞之间进行传递来影响靶细胞的活性。例如:PMP通过转移CD41抗原而增强骨髓来源的造血干细胞对胶原蛋白的黏附能力。由于PMP形成阶段保留了部分源细胞的细胞质,它有可能携带源细胞的蛋白质和RNA,并通过黏附或融用将它们传递给靶细胞,并导致靶细胞的重新编码。

  3 PMP的检测方法PMP生物学作用的发现对其检测技术提出了新的要求,目前流式细胞仪(FCM)仍为PMP常用的检测方法。近年该检测技术的进展主要为:

  (1)国际血栓与止血协会的科学标准委员会发布FCM 标准化PMP检测指南。(2)样本处理的标准化,包括抗凝剂的选择、离心、运输、保存及冻融技术。其中关键点是离心方案的选择以获得去血小板血浆,以及冻融技术以消除未完全移除的血小板产生PMP。此外,样品离心前的延迟时间、冰冻、运输、保存等环节也直接影响了PMP的检测数据。过去通常利用膜联蛋白V与PS的结合以检测PMP,新的研究表明用乳凝集素可以提高这种检测的敏感性,因为这种结合可以不依赖于Ca存在。但ELISA 表明,利用PS检测的PMP总量也包含了其他细胞分泌的微颗粒,而且并非所有PMP都是PS阳性,从而影响了准确率。考虑到FCM 的局限性,Strasser等 提出同时用ELISA和磷脂依赖的促凝血凝固试验来检测PMP的活性,但这三种方法检测结果的差别仍需慎重探讨。

  4 PMP与ACSACS包括不稳定型心绞痛、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)和非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI),而粥样硬化斑块破裂、继发血栓形成则是ACS的主要病理机制。PMP因其重要的促凝血活性而被认为在ACS的形成中起重要作用。

  4.1 与动脉粥样硬化的关系Csongradi等的研究表明,PMP和血浆P选择素水平与颈动脉内膜中层厚度以及其他血管危险因素例如空腹血糖、胰岛素及和三酰甘油水平密切相关。这提示粥样硬化的严重程度影响了PMP的产生。此外,早期的脂质代谢紊乱可以激活血小板进一步造成粥样斑块的形成。但PMP直接参与了粥样硬化的形成还是仅作为血小板激活的标志物尚需进一步证实。

  4.2 在ACS急性期中的标志物作用PMP因其与激活血小板的共有特性:表面PS和TF的表达及提供凝血酶原复合物聚集的接触面,逐渐被认为在ACS急性期进展中有独立作用,而不仅仅是作为血小板活化的标志物。

  Skeppholm等 发现,ACS患者急性期PMP水平比健康对照组显着升高,而在氯吡格雷和低分子肝素治疗后明显下降,但在6个月时依然高于对照组。

  Biasucci等 的研究表明,PMP水平在ACS患者急性期显着高于稳定型心绞痛的患者,而在STEMI和NSTEMI之间未发现明显差别,由于两组均行PCI治疗,进一步提示PMP水平的决定因素为动脉粥样硬疾病的严重性,而非解剖学上的损伤。并显示PMP水平与高敏C一反应蛋白水平显着相关。这可能提示PMP的升高与ACS急性期广泛的炎症反应和高凝状态有关。此外,在STEMI中PMP还反映了梗死面积的大小和处于危险中的缺血心肌。Suades等用从健康志愿者提纯的PMP诱导血栓试验证实了PMP在粥样硬化或损伤的管壁参与血小板的黏附和血栓形成,并用荧光标记法显示了血栓内部PMP的存在。因此,PMP作为心血管事件的独立危险因素是否应该被作为ACS的早期标志物进行常规检测受到了广泛讨论。

  4.3 治疗ACS的潜在策略鉴于PMP在血栓及其他血管性损伤疾病中的作用,控制PMP的释放将成为重要的药理学目标。PMP的降低一方面可以提示药物的有效性,同时可以减少PMP自身的有害作用。在充血性心力衰竭的研究中,氯吡格雷+阿司匹林降低PMP作用优于单用阿司匹林,而噻氯匹啶在糖尿病患者中有降低PMP的作用,这提示噻吩并吡啶类药物可以降低PMP的形成。虽然双联抗血小板药的有效性已被大规模临床研究所证实,关于它们通过减少PMP产生发挥作用的推断仍有很大的研究空间。Christersson等 发现,直接凝血酶抑制剂达比加群在体外研究中可以抑制凝血酶和ADP激活的PMP产生,且可以减少心肌梗死患者体内表达组织因子的PMP的产生,提示其抗血栓事件的潜在益处。而血小板激活时Ca入胞途径的发现也为调节PMP提供了新的靶点,以及使用Ca拮抗剂组患者PMP水平低于其他组。

  他汀类药物也因其在脂质代谢和激活血小板的作用在调节PMP水平的研究中受到重视。但这些药物对于PMP的直接作用尚存在争议,而几种微颗粒抑制剂如calpain抑制剂等是否适合人体内使用仍需要进一步探索。

  5 结语综上所述,PMP主要来源于活化的血小板,它有强烈的促凝血作用,并可以参与机体的免疫反应和传递生物信息。FCM 检测方法的优化为临床PMP定量检测提供了可能。PMP在ACS的发病机制中起重要作用,其是否应该被作为早期标志物值得进一步讨论。针对PMP的药物研发将为Acs等相关疾病的治疗提供新的策略。