肝豆状核变性又称Wilson病(WD)是目前少数可治疗的遗传代谢性疾病之一，其诊断主要依赖于实验室检查，尿铜是常用的诊断指标之一。尿液中的铜元素因含量低，基本成分复杂，个体差异较大，测定方法在灵敏度、准确度、抗干扰力和稳定性等方面要求较高。目前国内尿铜检测方法主要是采用原子吸收分光光度计火焰法(AAS)，该方法仪器简单，线性范围窄，重现性较差，受外界干扰因素影响大。本研究基于电感耦合等离子体发射光谱法(ICPAES)具有较高的精密度与准确度，符合实验室尿铜检测标准化的需求。
l 材料方法
1．1 标本尿液标本：来自南京市儿童医院检验科，采用浓硝酸5 ml防腐，收集3个不同尿铜浓度标本(20091N、20092N、20093N)24 h尿量，留取30 ml尿液样本待检。尿液标本外观清亮，尿常规检测结果正常，除外黄疸尿、乳糜尿等异常样本，同时收集我院就诊的100名体检儿童尿液作为正常对照。
1．2 仪器及实验器材
1．2．1 仪器法国JY公司ULTIMA一2型电感耦合等离子体原子发射光谱仪，按仪器操作规程进行检测。
1．2．2 实验器材所有与试剂、水、稀释液或样本接触的玻璃或塑料器材按下列步骤清洗：(1)使用常规清洗程序(含去污剂热水浸泡，自来水冲洗)；(2)在30％硝酸中浸泡过夜；(3)去离子水冲洗5～10 min；(4)无尘环境中倒置自然干燥。
实验条件：环境温度20～25℃，湿度20％一50％ ，电压波动<5％ ，氩气纯度99％，循环冷却水温23℃。
仪器高频发生器频率40．68 MHz，高频输出功率0．95 kW，反射功率<5 w，载气流量1.0 L·min～，等离子气流量12 L·min。，护套气流量0．2 L·min～，提升量1 ml·min～，输入狭缝20，输出狭缝l5，观i贝4高度10 mm，积分时间5 S 。
MilliQ净化水装置：密里博中国有限公司生产。用于实验室去离子水制备。去离子水：(≥15 MO·enl )，供试剂配制和器皿冲洗。
DmGONMED移液器：南京市计量局每年1次强检，厂家每年校准1次，每月1次内校正。
1．3 试剂美国SPEX公司，铜元素标准液。质控品：美国SPEX公司，多元素质控物。浓硝酸：南京化学二厂，优级纯。
1．4 AES尿铜检测操作程序(1)择铜的检测共振线324．754 nm，保证仪器稳定，重复检测同一空白液发射光强度，保证相对偏差(RSD)<2。
(2)测定O、10、2O、50、100 Ixg·L 质量浓度的铜标准液，仪器自动绘制标准曲线，并对空白液进行20次测定，仪器自动计算检出限。
(3)质控样品分析，样本重复3次，RSD<2，取均值。
(4)尿液样本分析，尿液标本用去离子水稀释5倍，每份样本重复测定3次，RSD<2，取均值；每检测5份样本，插入1份质控样本，并保证整个检测过程中质控样本变异RSD<2。
2 结 果
2．1 精密度将分装好的20091 N、20092N、20093N尿液标本，每日取出1瓶测定，每瓶为1批，各检测6批，每批标本重复检测3次，计算批内CV、批间CV和总CV。
2．2 回收率取1份体检尿液标本，分装5管，每管5 ml，其中1管做空白，另4管分别加入铜质量浓度为62．5、125、250、500 Ixg-L的标准品，测定其回收率。
2．3 灵敏度检测检测灵敏度是标准曲线的斜率。以发射光强度为y，浓度为 ，回归方程Y=25 385X+16 577，r=0．999 8。
见图1。
2．4 检出限测定测量空白液2O次的发射光强度，仪器会自动计算出样品的低检出限0．004 2 Ixg·L～。根据测量空白液2O次的发射光强度的标准差的3倍所对应的样品浓度为检测限的原则 。
2．5 干扰实验标本收集时，采用5 ml浓硝酸作为尿液防腐剂。
为了检测浓硝酸对尿铜检测的影响，分别定容5O ml的500、1 000、2 000xg·L 的质控液中加入浓硝酸1．25 ml，检测加入硝酸与未加硝酸质控液中铜的含量，见表3。实验结果显示，加入浓硝酸前后铜元素含量改变不明显。
因为ICPAES分辨率可达0．01 nm，尿中的低浓度元素不会对铜的测定产生干扰。采用尿中浓度较高的钾、钠、氯进行干扰实验，即在水空白溶液中按1：1分别加入25 mg·L钾、钠、氯的标准品溶液，测定铜含量，实验结果显示空白溶液中加入干扰元素后，未检测出铜含量的明显变化。
2．6 儿童尿铜参考值范围检测我院就诊100名体检儿童尿液铜，正常值范围(36．42-6．78) g·L～。
3 讨 论临床对尿铜测定结果的准确度与精密度要求较高。尿铜检测首先要考虑的是结果的可靠性，其次考虑自动化、高效l生、样本微量化等因素 ，批间精密度≤8％。ICP。AES检测3个不同水平的尿液标本，批间精密度≤5％ ，满足建立测量程序的要求。
影响ICPAES准确度和精密度的因素很多，主要有定标溶液的准确性、仪器及环境的稳定状态等。在标准液配制过程中严格遵守操作规程，避免容量瓶等实验器材和水的污染，保证操作环境稳定。有实验表明，储存超过3 d的空白液，其发射光和吸光强度都会明显增加，所以空白工作液和定标液均现配现用，以减少试剂对实验的影响。
实验结果显示，浓硝酸作为尿液标本的防腐剂，对检测结果无影响。有实验证实，绝大多数阴离子，如硝酸、草酸等酸根离子对尿铜的影响不大。本实验中发现，部分尿液标本中由于含较高浓度的钠离子和氯离子，高温下会在炬芯内壁上形成大量固体晶体，导致仪器的火炬熄灭，所以我们采用去离子水稀释尿液标本检测。经实验证实，对尿液标本以1：2、1：5、1：10的稀释对检测结果的影响甚微，考虑到检测样本的系检测的吸样量和发射光量，选择1：5作为尿液稀释的倍数，故本实验采用直接稀释法检测。
ICP-AES对检测环境要求较高，主要包括电压、温度、氩气纯度、排风、湿度、循环冷却水温等。温度和湿度对其检测结果影响较大，环境温度>30°C及湿度>80％ ，检测峰会出现明显漂移。此外，循环水温>
30℃亦会明显影响发生器功率的稳定，使得定标结果和检测结果出现漂移(>2 RSD)。检测前，仪器点火成功后应稳定半小时以上，输出功率稳定在1．0 kW，反射功率<5W。
IcpAES测定尿铜的方法具有准确度高、精密度高、检出限低、费用低的优点。同时，实验不需要常规的消化处理设备，减少了试剂的用量和预处理的时间，因此建议作为临床测定尿铜的常规检测方法。
