目前白血病治疗中棘手的问题是长期化疗药物导致的多药耐药现象,我们采用解毒化瘀方逆转多药耐药机制有一定效果,总结如下。

  1 材料解毒化瘀方水煎剂的制备:将解毒化瘀方(青黛10g、川芎10g、莪术15g、山慈姑15g、丹参20g、虎杖20g、重楼30g、补骨脂30g)的饮片放于煎煮容器内,加1~2L冷水浸泡30min,煮沸后文火煎熬,直至药物浓度为lg/mL,再将药液过滤出来,弃去药渣。

  含药血清的制备:将18只新西兰大白兔(购于贵阳医学院动物实验中心)随机分为3个不同剂量组,各组分别按低剂量组3g生药/kg体质量、中剂量组6g生药/kg体质量、高剂量组12g生药/kg体质量,灌服中药液,每Et 1次,连续3天。于末次给药后2h无菌条件下心脏取血,分离血清,组内血清混合,用0.22 In微孔滤膜过滤除菌,置一20℃保存备用。

  正常兔血清的制备:灌药前1天取兔血,分离血清,方法同前。

  试剂及仪器:RPMI一1640培养基(sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),MrIT试剂盒(凯基生物),Pgp试剂盒(北京博奥森生物)。超净工作台(中国苏州),CO2培养箱(美国NAPCO),通用酶标仪(BIOTEX美国),倒置显微镜(日本尼康TS100一F)。

  2 方法2.1细胞的培养HL60细胞的培养:HL60细胞接种于含5%胎牛血清的RPMI1640培养液,在37℃ 、50C02条件下培养,取对数生长期细胞,2~3天传代1次,更换细胞液。

  HL60/VCR细胞的培养:HL60/VCR细胞接种于含5% 胎牛血清的RPMI1640培养液,并加l0 g/inL的VCR维持,在37℃、5o~C02条件下培养,取对数生长期细胞,23天传代1次,更换细胞液。

  2.2细胞的检测MTT检测细胞毒作用:取1X10 对数生长期白血病HL60和HL60/VCR细胞株细胞,用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液,每孔180IXL,加至96孔培养板中,每组设3个平行孔,分3个剂量VCR组,加入不同浓度VCR后,细胞在培养板中适应生长12h,分别加人实验药物各20L,使每孔终体积为200 L;每一板次测定,均设一列全空白对照组,不加细胞和药物,同样作其它处理,光密度扫描时,以该列光密度值作本底,校正其它测量值。在37℃,5%C02浓度,饱和湿度条件下的培养箱内培养72h,每人5mg/mL的MTT液20L,相同条件下培养4h,离心去上清,每人二甲基亚砜(DMSO)150 L,微量振荡器振荡10min,充分溶解药物,于自动酶标仪检测各标本吸光度(OD)值,计算耐药倍数。

  免疫组化方法检测PgP表达:采用免疫酶标组化方法,将细胞悬液1×109/L加入24孔板中,每孑L lmL。其中12孔再加入含药血清,37℃、5%CO2孵育2h,细胞涂片,依次加入一抗、二抗、三抗,坚固红显色及苏木素复染,普通显微镜观察,阳性结果为玖瑰红色。

  2.3统计学处理检测结果均以x±s表示,IC50应用加权线性回归方法计算,样本间均数比较采用t检验,不同药物间的比较应用完全随机设计的方差分析,具体计算采用SPSS统计软件分析,P<0.05者为差异具有显着性。

  3 结果MTT细胞毒作用:在HL60、HL60/VCR细胞培养液中分别加入浓度梯度VCR,培养72h后,VCR对两种细胞是产生了不同的抑制作用,根据自动酶标仪检测HL60细胞IC50浓度OD值为33.127,HL60/VCR细胞IC50浓度OD值为149.001,求得HL60/VCR细胞耐药倍数为4.5倍。

  解毒化瘀药对HL60/VCR细胞PgP表达水平的影响:经免疫组化染色后,可见未加药HL60/VCR细胞被染成玫瑰红色,经含药血清处理后的HL60/VCR细胞,染色降低,与未加药的HL60/VCR细胞比较有显着差异,中药血清联合干扰素组亦可见染色明显降低,研究显示PgP在HL60/VCR细胞中成高表达,HL60细胞成低表达,加用解毒化瘀方含药血清处理后,高中低剂量组和干扰素组能够明显降低Pgp在HL60/VCR细胞中的表达,而空白对照组和兔血清组对表达无影响。

  4 讨论中医对白血病多药耐药逆转机制的研究也取得了一定的进展, 田亮等研究发现藤黄酸能通过下调Survivin及PgP蛋白的表达,增强耐药细胞对治疗药物的敏感性,从而逆转白血病K562/A02细胞的耐药作用。解毒化瘀方对白血病细胞多药耐药机制也有一定的逆转作用,中医认为白血病主要是因为温热毒邪的入侵,其耐药主要是由于毒邪留恋,扰乱血络,导致毒瘀互结,病情顽缠,反复发作 。解毒化瘀方中青黛清热解毒、凉血消肿,含有靛玉红对细胞内的周期依赖性蛋白激酶有抑制作用,致癌细胞的细胞周期停滞,从而抑制肿瘤细胞增殖。山慈姑清热解毒、消肿散结,含秋水仙碱,能抑制细胞的有丝分裂,对多种癌细胞有杀灭作用 。重楼清热解毒、消肿止痛,鄢圣英等 研究发现重楼复方水煎剂能使癌组织坏死,并且与药物的浓度呈正相关性。虎杖、莪术、川芎、丹参活血、行血、散血、凉血。补骨脂补肾助阳,其内含有补骨脂素为钙离子通道拮抗剂,蔡宇等 研究发现补骨脂素能够通过调节细胞内ca浓度逆转HL60/HT耐药细胞的耐药。白血病细胞耐药株HL60/VCR进行含解毒化瘀药的兔血清培养后,再进行涂片染色,其细胞的着色并不是很好明显的玫瑰红色,说明细胞中PgP的含量并不高。

  而没有加用含药血清的细胞组中的细胞染色比较明显,呈现很明亮的玫瑰红色,说明原耐药细胞上的PgP表达很高。通过两组的对比发现,解毒化瘀药含药血清能够降低细胞上的PgP蛋白,证明解毒化瘀方能够逆细胞药株耐药的机制是降低细胞上的Pgp表达。含解毒化瘀药血清组又分高中低3个组,在分别进行染色后发现着色深浅不同,含高剂量药物的血清组明显比含中剂量药物的血清组的着色浅,而含中剂量药物的血清组又明显比含低剂量药物的血清组的着色浅,说明不同的药物浓度对PgP的表达影响不同,其中浓度高的下调PgP的能力要比浓度低的强,即药物下调细胞上的PgP的强度与药物浓度呈正相关性,证实解毒化瘀药逆转细胞耐药的机制与其能够下调PgP有关,并且这种关系是正相关性。马武开等川在对白血病HL60/ADR细胞Mdrl、NFJB的表达及解毒化瘀药的干预作用的研究中也发现含解毒化瘀药浓度越高的血清作用效果越明显。另外,在药物的对照组中还有西药干扰素对照,虽然干扰素对耐药细胞也有逆转作用,但用干扰素与含药血清合用后效果更为明显,细胞呈现的颜色更浅,证实了含药血清对耐药细胞的逆转作用。