散发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)及大量蛋白尿的病因及发病机理至今仍未完全明确。研究表明，免疫及遗传因素可能起着重要的作用。

　　Podocin是2000年才发现的表达于肾小球足细胞裂孔隔膜处的特征性结构分子，其编码基因NPHS2定位于lq25～31。Podocin表达的缺失可导致常染色体隐性遗传激素抵抗型肾病综合征，临床表现为早期出现蛋白尿并迅速发展为终末期肾病。家族或非家族性激素抵抗型肾病综合征及局灶节段肾小球硬化型患者中，目前已有60多种NPHS2基因突变的报道，包括点突变、缺失、插入、框架漂移及启动子区突变等。对激素依赖或频复发性NS患儿是否存在NPHS2基因突变目前仍有争议。本研究应用直接测序分析了25例粤东散发性NS患儿NPHS2基因的多态性现象，拟了解该地区散发性NS患儿发病与NPHS2基因突变的相关性。

　　1 资料和方法

　　1．1 临床资料以2008年11月～2010年11月在本院住院的25例原发性NS患儿为研究对象，其中4例为频复发型，2例为激素耐药型，其余为激素敏感型。发病年龄(数据不符合正态分布)中位年龄6岁，年龄小19个月，大l3岁，其中男性20例，女性5例。排除有遗传性疾病家族史、乙型肝炎病毒相关性肾炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病、原发性高血压等，以及因药物、理化因素引起的肾脏病变导致大量蛋白尿患儿。对照组为正常体检儿童10例，所有人选者均获知情同意权。

　　1．2 方法

　　1.2.1 DNA提取留取入选者外周静脉血2mL，肝素抗凝。用常规DNA提取试剂盒抽提基因组DNA。用PCR体外扩增NPHS2共8个外显子片段，纯化后直接测序分析其多态性现象。

　　1.2.2 引物设计与序列引物设计分别位于各外显子两侧的内含子区域。

　　1．2．3 PCR反应条件按常规操作适当修改：PCR反应体系为50 L，含100 ng基因组DNA模板，5L5×PCR缓冲液，4L 10 mmol／L dNTP，特异性引物各1 L(20 mol／L)，Taq DNA多聚酶2.5U。PCR扩增条件：94ciC预变性5 min后进入循环：94~C 40 S，55℃ ～58℃(退火温度根据引物Tm值加以调整)40S(退火时间根据产物长度加以调整)，72℃ 40 S，35个循环，72℃延伸10 min。取10 L PCR产物加入含有0．5 mg／L溴化乙锭的2％琼脂糖泳槽，100V电泳30 min，紫外投射灯下观察。

　　1．2．4 测序PCR产物送上海英骏生物技术有限公司直接测序。

　　2 结果在人组的25例原发性NS患儿及正常对照中，检测NPHS2基因所有8个外显子，均未发现有错义突变，病例组检测到的同义多态性有位于外显子1的rs1079292：GGA／G1，都为纯合子G；位于外显子2的rs3738423：TC[C／T]，杂合3例，其余为纯合子C；位于外显子8中的rs1410592：GCC／T1，杂合14例，纯合子C 5例，纯合子T 6例，以及rs3818587：CTG／A1，其中杂合4例，纯合子A 21例(图1)，与正常对照组等位基因频率差异无统计学意义。

　　3 讨论 NPHS2基因共有8个外显子。自2000年以来，各国学者已经在多个家族性、散发性激素抵抗型肾病综合征(steroidresistant nephrotic syndrome，SRNS)及局灶节段肾小球硬化型(focal and segmentalglomerulosclerosis，FSGS)病例中发现了60种以上的突变。这些突变散发于NPHS2基因的8个外显子之中，并未发现特别的热点突变。患者大多在儿童期发病，也有在成人期发病。余自华等 曾报道，在23例散发SRNS儿童中发现1例NPHS2基因1082T>C杂合(外显子2，L351P)突变的患者，病理诊断为FSGS，后死于。肾功能衰竭。

　　目前国内外研究所报道的NPHS2基因的突变主要是单核苷酸置换所引起的错义突变，大片段的缺失、插人等严重的突变很少看到。而且这些错义突变主要是纯合子，或者是复杂的杂合子，即在一个患者的基因中存在两种或以上的错义突变。一般而言，预后也比较差。欧洲及北美的研究发现，在家族性SRNS和非家族性SRNS病例中，携NPHS2基因纯合及复杂杂合子突变的分别占到38％ 和26％。

　　这些患者往往发病比较早，但肾移植之后的复发率比较低。Ruf等报道，在26例携带NPHS2基因复杂杂合突变的(双突变)的NS病例中，22例对激素抵抗，1l例出现EsRD(end stage renal disease)；而9例单纯杂合突变的NS病例中，4例表现为激素敏感，只有1例发病8年后进展为终末期肾衰。Malina M等报道在1例纯合R138Q突变SRNS幼儿，环孢素A治疗获得部分缓解。对于仅有1个单纯杂合错义突变的病例，其引起NPHS2基因功能缺陷，进而导致蛋白尿和激素抵抗型肾病综合征的发生机制，目前尚有争议。Liu等曾报道，应用体外人工诱变技术建立NPHS1基因突变转染HEK293细胞后发现，细胞膜表面nephrin的表达消失了，或有明显的下调，而胞质内质网内有显着的nephrin蛋白表达。说明这些点突变在引起一个氨基酸残基置换之后，可能导致蛋白质空间结构如折叠的异常，进而导致蛋白质不能正常转运至生理位置，滞留于内质网等蛋白质的合成之处，从而引发蛋白质功能的丧失和缺陷。

　　尽管多个研究已证实NPHS2基因纯合或复合杂合突变导致SRNS，但是对NPHS2基因突变是否参与激素依赖型或频复发型肾病综合征(steroiddependent nephrotic syndrome／frequent relapsenephrotic syndrome，SDNS／FRNS)发病仍有不同的认识。Caridi等对59例SDNS／FRNS患儿进行NPHS2基因突变分析，结果4例(6．8％)患儿检坝0到NPHS2基因杂合突变，认为NPHS2基因杂合突变与原发性NS发生激素依赖或频复发有关。而Gbadegesin等 研究未能证实NPSH2基因杂合突变与SDNS／FRNS相关。他们应用DNA直接测序法对20例SDNS／FRNS患儿进行NPHS2基因突变分析，结果未发现患儿存在NPHS2基因突变。

　　NPHS2基因突变介导的家族性SRNS应该具有地域差异。与欧洲报道的较高发病率不同，Abid A等报道在145例巴基斯坦NS患者中(其中36例为先天或婴儿NS，39例为家族性NS，只有3．4％存在NPHS2突变，其中，家族性NS中未发现有突变。

　　付荣等在对3个南方汉族人家族性SRNS家系中NPHS2基因8个外显子及启动子检测中发现其不是主要致病原因。Chernin G等 毪 对18例SRNS非裔美籍儿童NPHS2基因检测发现未存在致病性突变，这与其他报道的接近30％~40％ 突变率不同。

　　ChoHY等报道在7O例SRNS韩国患儿中未检测出NPHS2突变。本研究在25例散发的儿童肾病综合征患者中，未发现引起蛋白表达异常的错义突变，但在外显子1、外显子2、外显子8中存在多态性。

　　在IgA肾病患者，NPHS1基因的多态变化与患者的蛋白尿等表型的严重程度相关，提示这样的多态性可能通过目前我们尚未明确的机制，影响该基因的功能。本研究中存在的多态性因人组数较少，是否具有潜在病理意义还有待进一步研究证实。

　　在本研究中的粤东地区散发性NS患儿中，其NPHS2基因未存在引起蛋白编码改变的错义突变，提示在该地区散发性NS患儿，特别是激素敏感型NS患儿，NPHS2突变致nephrin表达异常不是其主要发病原因，在发现的数个NPHS2多态性中是否存在病理意义仍须进一步研究。