一种细胞是否具有成骨细胞倾向是多种指标的结合，包括细胞的AIJP活性、体外矿化能力、骨钙素含量、PHT依赖的cAMP产生以及Ca2的掺人量等。而碱性磷酸酶的活性和矿化结节的检测，是鉴定成骨细胞的主要方法。生长因子作用于细胞一直是牙周组织工程研究的热点。本文用EMPs、BMP一2作用于体外培养的人牙周膜成纤维细胞，本实验主要是观察因子作用于人PDLCs后，细胞成骨活性的改变，为牙周组织工程寻求实验依据。

　　1材料和方法

　　1．1主要材料低糖DMEM培养基(Gibco美国)；新生牛血清(FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；胶原酶(Gibco美国)；釉基质蛋白(第四军医大学口腔医学院采用乙酸法从猪牙胚釉质中提取)；BMP一2(第四军医大学口腔医学院病理教研室)；免疫ABC试剂盒(DAKO，美国)；DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)；抗人波形丝蛋白单克隆抗体(DAKO，美国)；四唑盐(MrI-F)(Sigma，美国)；二甲基亚砜(DMSO)(西安化学试剂厂)；DG一3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；6孔板及96孔板(Costar，美国)1．2牙周膜成纤维细胞的获得取11～14岁龄因正畸需要拔除的无牙周病、龋病的健康新鲜前磨牙，锐利刀片刮除牙根颈部三分之一牙龈及牙周膜，采用全牙胶原酶消化法培养获得牙周膜成纤维细胞。为成纤维细胞形态，经免疫细胞化学检测，抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证实其外胚间充质细胞来源。取第3代细胞用于实验。

　　1．3牙周膜成纤维细胞的诱导

　　1．3．1实验分组1组：含10ml／LFCS的矿化培养液(成分：10nmol地塞米松、50mg／L维生素C和10mmol~一磷酸甘油的DMEM培养液)。2组：含1001~g／LBMP一2、10ml／LFCS的DMEM培养液。3组：含100mg／LEMPs、10ml／LFCS的DMEM培养液。4组：对照组，含10ml／LFCS的DMEM培养液。

　　1．3．2细胞的诱导取生长良好的第3代PDLCs浓度至2×104／ml。在两块96孔板中，每块板选3列，24孔，接种细胞悬液100l，标准环境下以10ml／LFCS的DMEM孵育24h，无血清DMEM培养液静息24h，弃去培养液及未贴壁的PDLCs，按实验分组各孔分别加入液体，对照组为仅含10ml／LFCS的DMEM。每个浓度组设8孔，每孔液量100l。

　　1．3．3碱性磷酸酶活性检测标准环境下孵育3d后，取一块板，用PH7．4的PBS洗3遍，吸干，每孔加入50l0．1％的TritonX一100，置4℃冰箱过夜，然后加入碱性磷酸酶底物，每孔100l，37oC孵箱内置30min，每孔加入0．2mol／L的NaOH50l终止反应，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长测各孔OD值。结果进行统计学分析，获得3天时各组显效差异。另一块96孔板按实验分组3d换液一次，标准环境培养，到第7d时，按上述方法测各组OD值。结果进行统计学分析，获得7d时各组显效差异。

　　1．3．4体外矿化能力检测取生长良好的第四代细胞，2．5g／L胰酶消化，调节细胞浓度，以2×105／ml的密度接种于一次性培养瓶，按实验分组3d换液一次，连续培养30d，在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。取30d标本，95％酒精固定后行VonKossa染色，观察矿化结节形成情况。

　　2结果

　　2．1OD值的测定结果

　　2．1．1因子作用于PDLCs3d时结果结果显示与对照组相比，矿化组、BMP一2组和EMPs组都有明显差异(见表1)，其中，BMP一2组升高明显。

　　因子之间差异不明显。

　　2．1．2因子作用于PDLCs7天时结果与对照组相比，矿化组、BMP一2组和EMPs组都有明显差异，其中，BMP一2组升高明显(见表2)。矿化组与BMP一2组之间差异不明显，EMPs组作用较弱，与矿化组和BMP一2组之间差异明显。

　　2．1．3因子作用3～7d时间段内碱性磷酸酶活性差异用第7天所得数据一一对应减去第3天所得数据，得到3～7d时间段内碱性磷酸酶活性改变的差异，经统计分析，结果表明：与对照组相比，矿化组和BMP一2组有明显差异，EMPs组与对照组相比，改变不明显(见表3)。矿化组和BMP一2组之间无明显差异，但与EMPs组有明显差异。

　　2．2矿化结节染色倒置显微镜下观察，实验组5d时细胞即长满一次性培养瓶，7d时出现局部细胞聚集，以后细胞呈复层生长，为局灶状。随后，矿化组和骨形成蛋白组局灶中央出现许多颗粒样改变。15d时即观察到有矿化结节形成，肉眼可见，呈白色结节状，以后矿化结节逐渐增大，数量增多。

　　与矿化组和骨形成蛋白组相比，釉基质蛋白组进展较慢，但到30d时也可以观察到细小矿化结节形成。vonKossa染色将白色结节部位染成黑色，边界不清(附图1，2)。

　　3讨论运用釉基质蛋白和骨形成蛋白用于促进牙周再生是目前临床的热点研究之一。国内外学者普遍认为BMP一2促进PDLCs成骨细胞表型的表达。并且，KobayashiM指出BMP一2能增加人PDLCs的碱性磷酸酶活性，促使人PDLCs向成骨细胞表型分化，进而诱导新生牙槽骨和牙骨质形成。

　　本实验结果表明，加入BMP一23、7d时间点，PDLCs的碱性磷酸酶活性较对照组明显升高，与传统的矿化诱导结果无明显差异。3～7d时间段内AIJP活性的升高与对照组差异明显，与矿化组差异不明显。说明在BMP一2作用下，PDLCs的碱性磷酸酶活性明显升高，向成骨细胞方向分化。而EMPs作用3d后，PDLCs的AIJP活性较对照组明显升高，与传统的矿化诱导结果无明显差异。但在7d点时，PDLCs的AIJP活性较对照组升高不明显，与传统的矿化诱导和BMP一2结果差异明显。37d时间段内AIJP活性的升高与对照组差异不明显，与矿化组和BMP一2结果差异明显。说明在EMPs作用下，前3dALe活性明显升高，但后来作用较差。同时不能排除前3dALP涪l生的增高仅仅是EMPs促增殖的结果。

　　有实验发现在EMPs作用下PDLCs碱性磷酸酶的活性大大提高，PDLCs在EMPs作用下形成牙周硬组织的能力提高。但是，对于EMPs是否具有骨诱导作用也有不同的意见。BoyanBD等为研究釉原蛋白在成骨中起何种作用设计了一个实验。将不同剂量的釉原蛋白与含或不含骨诱导因子的脱矿冻干骨配伍复合植入裸鼠的腓肠肌内。8周后取材制成组织切片观察植入物周围成骨的情况。实验证明，釉原蛋白本身没有骨诱导作用，但是一定剂量的釉原蛋白却能扩大原本存在的骨诱导因子的骨诱导作用，是一种成骨促进因子。本实验也得出类似结论。

　　另外，本实验观察了PDLCs在因子作用后形成矿化结节的能力。结果发现实验各组PDLCs较对照组更早出现细胞聚集，并出现矿化结节。这一方面可能由于EMPs、BMP2提高了PDLCs的AJP活性，使细胞表现出较强的形成矿化组织的能力，另一方面也不能忽视EMPs和BMP2对细胞的促增殖作用，因为干细胞在经过了一定的增殖阶段后才进入分化阶段。