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自从1961年在英国发现首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），MRSA和耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）在世界上迅速蔓延，对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增强的葡萄球菌造成的感染已成为日益严重的临床问题。现已明确，大量产生的一种新的青霉素结合蛋白―― ―PBP2a是葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要原因。mecA基因是PBP2a的编码基因，只存在于葡萄球菌中，因此，mecA基因可作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子标志［1］。本文依据多重聚合酶链反应（PCR）的基本原理，并结合本实验室的具体特点在葡萄球菌的 16S rRNA基因内设计葡萄球菌的通用引物、耐甲氧西林葡萄球菌的mecA基因特异引物以及金黄色葡萄球菌（SA）的femA基因特异引物。采用多重PCR技术对标本进行快速检测，取得了较好的结果，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1标本及其来源 金黄色葡萄球菌标准株（ATCC25923）、大肠埃希菌标准株（ATCC25922）为本室保存;mecA基因阳性标准MRSA菌株（SA0129）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）标准菌株（SA0131）由美国Pfizer公司研究所提供。临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提 供，其中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA） 33株，MRSA 53株，甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌（MSCNS）135株，MRCNS 41株。标本来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。
1.1.2实验试剂与仪器 基因组DNA提取试剂盒购自美国Promega公司;PCR试剂（TaqDNA聚合酶、4×dNTPs、10×buffer等）购自加拿大MBI公司;DNA Marker DL2000购自大连Takara公司;利用DNAStar软件设计的引物由上海生工公司合成。API-Staph鉴定系统、鉴定用生化和药敏试剂及细菌培养瓶均为法国梅力埃公司产品。血液琼脂平板、革兰染色液等均为本室自行配制。4800型DNA扩增仪为美国PERKIN公司产品;Microscan全自动细菌鉴定仪为美国DaDe Behring公司生产。
1.2 方法
1.2.1引物的设计 在GenBank中收集mecA、femA及葡萄球菌的16S rRNA基因序列，应用DNAStar Megaline软件进行分析，用Primer Prim-ier软件设计mecA、femA基因及葡萄球菌属的扩增引物。设计2条葡萄球菌的16S rRNA通用引物，P1:ACGTGTAAGTAACTGTGC，P2:TGCG-GTTGGATCCCCTCCTT，扩增产物约为1 088 bp片段;2条耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的引物，M1:TAGTTGTAGTTG-TCGGGT，M2:TATCG-GACGTTCAGTCAT，扩增产物约为165 bp片段;设计2条金黄色葡萄球菌femA基因的引物，F1:ACAGTCATTTCACGCAAAC，F2:ACCTGTA-ATCTCGCCATC，扩增产物约为314 bp片段。
1.2.2细菌DNA的提取 按美国Promega公司生产的基因组DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）操作说明书操作。
1.2.3目的基因的PCR扩增 取上述提取的MSSA、MRSA、MRNCS及大肠埃希菌标准株（ATCC25922）对照菌株的DNA各1 μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系，引物、MgCl2 、dNTPs终浓度分别为2 μmol/L、250 μmol/L、250 nmol/L，1×PCR buffer，6×105 U/L Taq酶，反应总体积 25 μL 。PCR反应参数:94 ℃预变性6 min;94 ℃ 60 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃延伸 10 min 。扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线灯下观察结果。
1.2.4 多重PCR扩增敏感性测定 将金黄色葡萄球菌标准株（ATCC25923）接种于LB培养液中， 37 ℃ 摇床振荡培养至对数生长期，用ddH 2 O作系 列1∶10稀释，每一稀释度各吸取1 mL，倾注适量56 ℃的营养琼脂，37 ℃过夜后计数菌落形成单位（CFU）;同时，菌株的每一稀释度均按1.2.2方法提取DNA后，用三套引物进行多重PCR扩增，检测能产生特异性产物的最低稀释浓度。
1.2.5临床标本的常规细菌学检测 用常规细菌的琼脂稀释法药物敏感试验鉴定MRS，结果判断参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的判断标准。苯唑西林的最小抑菌浓度（MIC）≤ 8 mg・ L -1为敏感，816 mg・L-1为耐药。
2 结果
2.1 多重PCR扩增的敏感性 将金黄色葡萄球菌标准株作1∶10系列稀释后分别进行PCR扩增，结果显示最低可检测出8×103CFU/L的金黄色葡萄球菌。
2.2 部分菌株多重PCR扩增结果 用3对引物P1、P2、M1、M2、F1、F2对金黄色葡萄球菌、MRSA、MRCNS进行多重PCR扩增，均有1 088 bp条带产生，同时MRSA有165 bp、 314 bp 两条带产生，MRCNS有165 bp条带产生，金黄色葡萄球菌有314 bp条带产生，大肠埃希菌无任何带产生。见图1。
图1 MRS mecA基因、femA基因、16S rRNA多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果（略）
M为DL2000 DNA Marker;① MRSE标准株（SA0131）;②耐甲氧西林溶血葡萄球菌;③耐甲氧西林表皮葡萄球菌;④耐甲氧西林腐生葡萄球菌;⑤金黄色葡萄球菌标准株（ATCC29213）;⑥、⑦甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌;⑧MRSA标准株（SA0129）;⑨甲氧西林敏感表皮葡萄球菌;⑩对照菌株（大肠埃希菌标准株ATCC25922）
2.3262株葡萄球菌多重PCR扩增结果 以琼脂稀释法为金标准，将262株葡萄球菌分为MRSA、MSSA、MRCNS、MSCNS，多重PCR扩增有4种模式，见表1。100%的MRSA含mecA基因和femA基因，仅5%的MSSA含mecA基因和femA基因。mecA基因在MRCNS、MSCNS中的 检出率分别为 100%、2.6%。100% 的金黄色葡萄球菌含femA基因，而femA基因在凝固酶阴性葡萄球菌中未被检出。
2.4 多重PCR扩增与琼脂稀释法的比较
2.4.1以mecA基因阳性判断MRS 262株葡萄球菌中若以mecA基因阳性作为判断MRS的指标，与琼脂稀释法比较，多重PCR的灵敏度为100%，特异度为96.6%，阳性预测值为100%，阴性预测值为99.0%。见表2。
2.4.2以mecA和femA基因阳性判断MRSA 262株 葡萄球菌中若以mecA基因和femA基因阳性作为判断MRSA的指标，与琼脂稀释法比较，多重PCR的灵敏度为100%，特异度为99.5%，阳性预测值为100%，阴性预测值为98.5%。
2.5 葡萄球菌的耐药率 采用多重PCR扩增262株临床分离的葡萄球菌，mecA阳性206株，阴性56株，耐甲氧西林葡萄球菌检出率为78.6%;176株凝固酶阴性葡萄球菌中（以femA阴性为判断标准），mecA阳性139株，阴性37株，MRCNS检出率为79.0%;86株金黄色葡萄球菌中（以femA阳性为判断标准）mecA阳性67株，阴性19株，MRSA检出率为78.0%。
3 讨论
葡萄球菌不但是医院内感染最常见的病原菌， 而且耐药性逐年增强。特别是MRSA和MRSE常造成医院内严重感染，且难以控制。据1980年Vir-ginia医学中心报道，40%菌血症、20%肺炎及49%伤口感染系由MRSA引起，而且病死率很高，一般在10%～30%，有时可高达50%［2］。20世纪60年代出现MRSA以来，MRSA占金黄色葡萄球菌感染的比例亦逐年升高。国内文献报道，上海地区70年代最早检出MRSA只有5%，1985～1988年上海、北京等地区为12%～24%，1994～1996年上升到50.00%～77.90%。2003年，上海各教学医院中MRSA感染占全部金黄色葡萄球菌感染的60%～80%［3］。本文研究结果表明，葡萄球菌的耐药率已达 78.6% ，其中凝固酶阴性葡萄球菌的耐药率 为79.0% ，金黄色葡萄球菌耐药率为78.0%。从青岛市的检测结果看，2000～2002年MRSA占葡萄球菌的15.71%，占SA的57.14%［4］。SA的耐药率是呈上升趋势的，该菌感染已成为当今世界范围内医务界面临的严重问题。mecA编码翻译β-内酰胺类抗生素亲和力低的PBP2a，大量表达青霉素结合蛋白PBP2a，PBP2a可替代高亲和力PBPs行使功能，促进细菌胞壁合成而耐药，是引起耐药的根本原因［5］。而femA是MRSA耐药辅助基因，所编码蛋白与细胞壁肽聚糖五甘氨酸桥合成有关，femA是金黄色葡萄球菌的特异基因，与其他细菌包括表皮葡萄球菌不存在交叉，具有严格的种属特异性。研究结果证实，femA也是MRSA耐药辅助基因，其编码相对分子质量为48×103 的蛋白参与细菌胞壁肽聚糖五甘氨酸桥合成。femA插入失活，将导致细胞壁结构改变，而对β-内酰胺类抗生素敏感性上升［6］。本研究结果表明，100%的MRS含mecA，金黄色葡萄球菌均表达femA基因，与PASCAL等［5］的报道一致。本实验中femA基因在MRSA、MSSA中分布率均为100%，说明femA的辅助耐药性与femA是否存在无关，而可能与femA表达水平有关。琼脂稀释法是NCCLS推荐的检测MRSA的经典方法，该方法准确、可靠，但费力、耗时，成本较高。我们采用多重PCR技术检测葡萄球菌的16S rRNA、mecA基因与femA基因，直接筛检MRS，具有快速、敏感性高、特异性强的优点。以广泛存在于葡萄球菌中的16S rRNA基因片段作为扩增的内参照，只有当该基因片段被扩增出，而靶基因片段未被扩增出时，才能断定待测菌不携带靶基因，而当两者均未扩增出时，说明扩增失败，需要重复实验，不能说明待测菌不携带靶基因，这样就避免了假阴性的出现。实验中曾出现2株菌16S rRNA和mecA扩增产物阴性，重复实验后证实两者均为阳性，如不设16S rRNA基因片段作内部参照物，就会漏掉这两株携带mecA的葡萄球菌。我们以mecA基因阳性来诊断MRS，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为100%、96.6%、100%、99.0%，若以mecA基因和femA基因均阳性作为判断MRSA的指标，则灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为100%、99.5%、100%、98.5%。其中，2例琼脂稀释法阴性而mecA基因阳性的菌株，一株同时培养出大量的铜绿假单孢菌，再经过高选择性的培养液培养，也分离出了MRSA;另一株在随后经过持续性培养，同样证实为MRS。采用多重PCR技术可在同一系统内快速鉴定标本中携带的葡萄球菌16S rRNA基因、mecA基因和femA基因，而整个过程只需6 h。因此，多重PCR检测MRS具有快速、敏感、特异性强的优 点，能及时提示临床使用糖肽类抗生素，迅速控制耐甲氧西林葡萄球菌造成的感染，限制其播散。
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