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白内障(cataract)是一种常见的致盲眼病,它是多种因素共同作用的结果,氧化损伤是其发病机制之一[1]。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力入手,利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧

化产物,阻止或逆转晶状体变浑浊,从而抑制或延缓白内障的发生发展[2]。石斛是一种名贵中药材,抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实,石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D 半乳糖性白内障起到防

治作用[3],石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质(LPO)的产生[4],这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而,石斛化学成分复杂,其抗白内障的具体有效成分是什么,至

今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体,对金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)的粗提物总生物碱(total alkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白内障作用进行了探讨,现报道如下。
   
  1  材料和方法

  1.1  动物  4~5周龄Wistar大鼠20只,体质量80~120g,雌雄不限,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:粤临证字2007A025。

  1.2  药材和试剂  金钗石斛由贵州赤水信天石斛有限公司提供,经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定。DMEM低糖培养基(杭州吉诺生物医药技术有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);

磷酸盐缓冲液(PBS,福州迈新生物技术开发公司);体积分数30%过氧化氢(H2O2,浙江临安化工二厂);吡诺克辛钠滴眼液(武汉天天明药业有限责任公司,批号:070102);Bradford蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生

物科技有限公司);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。
   
  试剂配制如下。改良碘化铋钾试剂:甲液:0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸,加水40mL;乙液:8g碘化钾溶于20mL水中;将甲液与乙液等量混合后,取1mL与2mL醋酸混合,供生物碱的显色用。Molish试剂:甲液:α 萘酚

1g,加体积分数75%乙醇至10mL;乙液:浓硫酸;供多糖的检测用。

  1.3  仪器  E 52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ DIII型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);BS110S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);HI 98128型pH计(北京HANNA);SW CJ IF型

超净台(苏州净化设备厂);Galaxy s型CO2培养箱(美国RS Biotech);ST PT型解剖显微镜(日本OLYMPUS);5810 R型低温高速离心机(德国Eppendorf );7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

  1.4  金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识  金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法参照文献[5-6]并略加改进:干燥金钗石斛切碎打成粗粉,加入体积分数为95%乙醇85℃回流提取(4h/次×3次),合并提取液

,减压回收乙醇后得到石斛浸膏,加1moL/L HCL调节浸膏的pH为3,氯仿萃取3遍后,弃氯仿层,加浓氨水调母液pH=11,再经氯仿萃取3遍,将氯仿层合并,减压浓缩,挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加入

20倍体积的水,100℃回流提取(2.5h/次×4次),合并提取液,减压浓缩至一定容积后,加入体积分数95%乙醇,直至醇浓度为70%,置于冰箱内,隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍,再经Sevag法除蛋白处理,冷冻干

燥,得到粗多糖。总生物碱的检识参照文献[7]:取少量分离所得的总生物碱于试管内,加入蒸馏水和10μL二甲基亚砜(DMSO)将其充分溶解,滴在硅胶板上,喷雾改良碘化铋钾试剂后,可见硅胶板上滴了提取物溶液的点

显现出非常明显的桔红色斑点,由此证明提取物为生物碱。粗多糖的检识参照文献[7]:取多糖水溶液1mL加入Molish试剂3滴,摇匀,倾斜试管,沿试管壁缓慢滴加1mL浓硫酸,静置,可见在试液与浓硫酸交界面产生非常明显

的紫色环,证明提取物为多糖。

  1.5  药物配制  用PBS分别将总生物碱和粗多糖配制成浓度为50mg/mL的溶液(生物碱加10μL DMSO助溶),0.22μm微孔滤膜过滤灭菌处理后-20℃保存待用。

  1.6  晶状体的培养及分组  参照文献[8]的方法并略加改进:颈椎脱臼处死大鼠,用眼科剪镊迅速摘取双眼眼球,以含800U/mL青霉素、800μg/mL链霉素的冷PBS液漂洗眼球后,投入含相同浓度双抗液的PBS液中浸泡,

转入超净台。约10min后将大鼠眼球转移至含500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素的DMEM培养液中,小心从眼球后极部剪开巩膜,取出晶状体,去除晶状体表面的虹膜和玻璃体,晶状体经PBS液漂洗2遍后,再用DMEM液漂洗1遍,

然后再放入已预热的24孔组织培养板中培养,每孔含1mL DMEM培养基(含体积分数20%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、100 μg/mL链霉素),预培养5h(37.0℃、体积分数5%CO2)后,剔除受损伤或已混浊的晶状体。将35只未受损

伤、透明的晶状体按照随机原则分7个组培养,每组5只:正常对照组(DMEM培养基+100μL胎牛血清),模型组(正常对照组培养基+2mmol/L H2O2),生物碱高、低剂量组(正常对照组培养基中各加入2mmol/L的H2O2,同时分

别添加4、2mg/mL生物碱),多糖高、低剂量组(在正常组培养基中各加入2mmol/L的H2O2,同时分别添加4、2mg/mL粗多糖),阳性对照组(正常对照组培养基+2mmoL/L的H2O2+100μL吡诺克辛钠滴眼液)。上述各组培养基均

含100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素。

  1.7  观察并照相记录晶状体混浊度  加药培养后,每6h更换1次培养液以保持H2O2浓度不变。同时观察并记录各组晶状体混浊度。离体培养晶状体混浊度的分级方法参照文献[9]:在黑色背景下设计1mm×1mm的黑色方格

图,将被检晶状体置于"+"字交叉的黑色线条之上,在解剖显微镜下观察晶状体,按透过晶状体所能看到的线条清晰度进行分级。"-"表示线条清晰可见,为完全透明;晶状体"+"混浊:线条模糊,但轮廓尚可辨;"++"混浊:线

条轮廓不清,仅中央部隐约可见;"+++"混浊:线条完全不见,晶状体全部混浊。后以各组晶状体混浊度,即"+"出现量的多少进行统计学处理。培养后24h,给各只晶状体拍照。

  1.8  晶状体水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性检测  晶状体拍照后,用冷PBS液洗涤2遍,尽量洗净培养液,再用滤纸吸干水分,称质量。按质量与体积比为1∶10的量加入冷PBS液,在冰浴上充分匀浆后倒入2mL离心管中

,4℃、12000r/min离心20min,取上清即为晶状体水溶性蛋白,采用Bradford法检测定蛋白含量。取剩余上清,分别采用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量,采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶(T SOD)活性,采用

硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TBA)法检测MDA活性,以上操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

  1.9  统计学方法  应用统计软件SPSS 11.5对所有数据进行统计分析。
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