本文是一篇专业的医学论文,主要是关于ONO-AE-248对诱发中性粒细胞非凋亡性程序化,详情请看下面的介绍。

  死亡中Bax-ot表达的研究术中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,PMN)是机体主要的白细胞之一,是固有免疫应答的主要效应细胞。它是由骨髓造血干细胞分化产生的终末分化细胞,一旦分化成熟就启动其自发性凋亡程序的特征?。然而,近年来许多研究学者研究并发现凋亡并非是程序化细胞死亡的唯一形式,还可能存在不同于典型凋亡的其它主动性细胞死亡形式。本文研究组前期的研究人员运用光镜、电镜和流式细胞术等技术观察PMN形态学和生化特征变化时发现,ONO-AE-248能诱发体外培养的人中性粒细胞发生与凋亡和坏死相区别的主动性程序化死亡,它可能属于非凋亡性程序化细胞死亡。然而,我们对于这一细胞快速死亡的相关基因调控和细胞生化信号转导机制还缺乏一定的认识和了解。近期研究表明,Bcl一2家族(A1,Bax,Mc1.1,Bak等)在细胞凋亡过程中起着关键性调控作用,Cory等研究发现,PMN不表达Bcl-2,其它抑制凋亡基因在PMN中的表达水平较低,这与PMN自发性凋亡机制有关。本文运用RTPCR技术,从mRNA水平对Bax一0在ONO.AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡中的表达进行初步分析。在这方面的研究可有助于在分子机制上深化对程序化细胞死亡的理解,并进一步为这种新型细胞死亡方式的确立提供实验和理论依据。

  1材料和方法

  1.1材料ONO.AE-248由日本北里大学医学部临床免疫学研究室赤星透教授惠赠;RPMI1540培养液、小牛血清购自Gibco公司;Trizol、引物购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自TOYOBO公司。

  1.2方法

  1.2.1细胞分离与培养抽取健康人外周静脉血经Ficoll密度梯度离心后,取PMN层,用8.3g/LNHC1溶液裂解去除红细胞,以PBS洗涤3次后,用RPMI1640(含100ml/LFCS)制成细胞悬液。用台盼蓝拒染试验及怀特一姬姆萨混和染色法鉴定细胞活力与纯度均>96%。将分离的PMN(2xl0。个/L)加于24孔培养板中,同时设立ONOAE-248药物刺激组(终浓度为5x10~mol/L),INF-药物刺激组(终浓度为20ng/g),LPS药物刺激组(终浓度为1fn1)和空白组,各设3个复孔,置CO孵箱中培养。

  1.2.2总RNA提取收集预定时间(2h)不同培养状态下的中性粒细胞,各组总RNA按Trizol实验标准步骤提取,紫外分光光度计检测A猢和A。计算A/A。,检测RNA含量,1%琼脂糖电泳检测RNA三条亚基条带。

  1.2.3RT-PCRPrimerPrimer5.0引物软件设计特异性引物Bax一:sense:5A0CTGCAGAGGATGArITIGCC-3,anti-sense:

  CAArcTCCAGCCCATGAr(一3:32m:sense:5'-CTCACGTCATCCAGCAGAGA-3,antisense:5一CAAGCq3TGAGTGCAAGAGA-3。逆转录反应体系总体积为20,含8l5xRTBufer,1lRT.Enhancer,1Super.RI,2RandomPrim.er,2ReverTraAce,3VaRnaseFreeH2O,3lRNA液。反应程序:30℃,lOmin;42℃,20min;99oC,5min;4℃,5rain。反应结束后,置一20℃保存备用。PCR扩增反应体系总体积为25,含逆转录反应后原液5;RNaseFreeH20:14.5;dNTPMixture(10mM):0.5;10×RTBufer:2.5l;MgCl2:1;Bax-ot引物:11(上、下游引物4fro.51x1);32-微球蛋白引物:1(上、下游引物各0.51);Opti-Taq:0.5Va。反应程序:预变性72℃,3min;变性94oC,30s;引物退火52℃,30s(同管扩增);延伸72℃,lmin;循环30次;终延伸72℃,5rain;保存于4~C中。取8样品+26×电泳上样缓冲液2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

  1.2.4图象分析用凝胶定量软件Quantity-one(Bio.Rad)分析系统检测RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值。所有光密度测值均在相同的光学条件下完成。

  1.2.5细胞蛋白质的提取和定量收取培养24h的PMN,1500r/rain离心5min,加入细胞裂解液(8mol/L尿素,4OLCHAPS,2mmol/LTBP,2ml/LBioLyre),吹打均匀,4℃振摇30min,收集细胞裂解液于EP管中,4℃12000r/min离心15min取上清液用Bradford法行蛋白定量。

  1.2.6Western.blot检测Bax一0L蛋白的表达PVDF膜与鼠抗人Bax.单克隆抗体(1:1000)室温育膜60rain;PBST缓冲液洗膜10minx3次;HRP标记抗鼠二抗1:5000育膜6omin,洗膜。将PVDF膜置于化学反应液中5min进行显色,取出洗净膜将其放置荧光化学发光图像分析仪中进行曝光,采用Quantityone分析系统检测蛋白条带的平均密度值,分析目的蛋白相对表达量。

  1.2.7流式细胞仪AnnexinVFITC/PI双参数检测细胞凋亡率预定时间收获细胞,1500r/rain离心,PBS洗涤并离心;4℃,3%甲醛冰上固定30min,离心弃去固定液;PBS洗涤并离心;弃上清液,用Bindingbufer(试剂盒自带)100重悬细胞,转入流式收集管中,AnnexinVF1TC(5)和碘化丙啶PI(2.5)双染色;4。C避光孵育10min,每管再加结合缓冲液Bindingbufer400悬浮细胞;空白对照调零,流式细胞仪分析凋亡细胞发生率(Ex=488nm,Em>630nm)。

  1.3统计学处理所有结果均取自1次代表性实验,并被3次独立实验证实。用统计软件为SPSS10.0处理。计量资料以x4-s表示。两样本均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

  2结果

  2.1流式细胞术检测ONO-AE-248作用于PMN的凋亡率ONO-AE-248(5×10mol/L)处理组(B、D)比未处理组(A、C)AnnexinV-F1TC、PI双阳性细胞数随着培养时间的推移有较大增幅。

  2.2 ONO-AE-248对PMNBax-mRNA表达的影响在图2A中629bp左右处可见32-m内参条带,300bp左右处为Baxot目的条带。实验结果显示,在各组中Bax.0mRNA均有较强的表达,并且各组间无明显差异。以Bax.B.m的光密度比值反映Bax.mRNA的表达量:LPS刺激组为0.80±0.021;TNF-仅刺激组为1.03±0.006;ONOAE-248刺激组为1.30±0.018;自发性凋亡组(空白组)为1.12±0.014。ONOAE-248实验组与TNF促凋亡组和自发性凋亡组相比较,差异无显着性意义P>O.05(图2B)。

  2.3WesternblottingPMNBax-仪检测蛋白的表达图3示Bax.蛋白在实验组表达较TNF.组及空白对照组无明显差异。3讨论本文研究组前期首次发现前列腺素E:受体亚型3(EP3)激动剂ONOAE-248能诱导中性粒细胞发生非凋亡性程序化死亡,并已从形态学和一般生化特征等方面证实,其与凋亡具有明显的不一致性。但目前的研究成果主要在对形态学的描述上,涉及分子调控机制方面的研究很少。本文研究初步探讨了Bcl-2家族相关基因在这种新型细胞死亡方式中的表达及作用。

  B细胞淋巴瘤(B.celllymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白是一类在细胞凋亡过程中起着关键调控作用的蛋白质,其表达的改变不仅影响DNA损伤或周期异常细胞的正常凋亡,还能影响正常细胞自身的凋亡,在人类的很多疾病中它都发挥着重要的作用,对疾病的发生、发展和转归有重要的影响。

  它主要分为两类:一类是抑制细胞发生凋亡;另一类是促进细胞发生凋亡。A1、Mcl一1和Baxd是Bcl-2家族的重要成员,已有的研究表明,A1、Mc1.1在细胞凋亡中起着抑制的作用,Bax.在细胞凋亡中起着促进的作用。本文研究结果显示,经ONO-AE-248作用的PMN非凋亡性程序化死亡组中Bax-有较高的表达,与TNF.促凋亡组和自发性凋亡组相比较,Bax的表达无显着性差异。流式结果显示,经ONO-AE-248作用的PMN却发生快速死亡。因而进一步表明,ONOAE-248诱导的PMN非凋亡程序化死亡的确有别于传统凋亡,但不同的基因在ONO.AE-248介导的细胞死亡信号传导和基因调控可能与传统的细胞凋亡有部分相同和相关,也可能发挥的调控作用是不相同的。我们下一步将运用激光扫描共聚焦显微镜等技术,对ONO.AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡程序化死亡的分子、基因调控机制和生物学意义进行深入研究。