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羊肚菌多糖提取、性质测定实验报告-中华医院管理投稿

时间:2012-04-06 10:29来源:未知 作者:360期刊网2 点击:

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1  材料与方法
  1.1  试药与仪器
  供试菌种羊肚菌GIM5.69[(Morchella esculenta (L.) Pers.)]及黑脉羊肚菌GIM5.29(Morchella elata),广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供,标准葡聚糖Dextran T70为Pharmacia 公司产品,其余试剂均为国产分析纯。Labofuge 400R台式冷冻离心机(德国Heraeus),恒温培养箱(上海智城),RE-52旋转蒸发仪(上海青浦沪西),BP211D电子天平(德国Sartorius),MLS- 3750灭菌器(日本Sanyo)。
  1.2  培养基及培养方法
  斜面培养基:采用PDA培养基,含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%,无菌接种后25 ℃培养7~10 d,4 ℃保存。液体种子培养基:含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%;每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后从斜面培养基上接种,25 ℃摇床培养10~14 d,转速180 r/min。发酵培养基:含蔗糖4%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.15%、酵母膏0.5%;每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后按2%接种量吸取摇床培养的种子培养液接种,25 ℃摇床培养10~14 d,转速180 r/min。
  1.3  多糖提取
  经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取,本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取,并将结果与常规热水浸提加以比较,以获得优化多糖提取方式。
  1.3.1  热水浸提
  称取5 g干菌丝体,粉碎后加入40倍体积的去离子水,90 ℃,150 min,残渣重复浸提2次。合并上清液,过滤。在37 ℃条件下,上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMW3500透析袋透析2 d。透析液加3倍95%乙醇沉淀48 h后离心(3 500 r/min,20 min,4 ℃),弃去上清液,收集沉淀,以少量去离子水溶解,真空冷冻干燥得羊肚菌菌丝体粗多糖。
  1.3.2  超声提取
  称取5 g干菌丝体3份,粉碎后加入40倍体积的去离子水,分别按5、10、15 min 3个水平进行超声波处理,超声频率为40 kHz。然后按热水浸提方式提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
  1.3.3  酶法提取
  经正交试验[4]确定,对于果胶酶和纤维素酶而言,酶量的极差最大,是影响多糖提取率的关键因子,其次是酶处理的时间,温度的影响最小,酶处理的最佳条件是酶加量15%、50 ℃、3 h。故试验中称取5 g干菌丝体粉碎,加入20倍体积水,加入0.15 g酶,酶解3 h,酶解后加入20倍体积的水,热水浸提提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
  1.4  多糖得率比较及多糖含量测定
  称取不同提取方法所获得的粗多糖,比较其重量。同时鉴于粗多糖中可能含有一定杂质,对试验结果有影响,进一步对粗多糖中多糖含量进行检测并加以比较。配制标准葡聚糖(Dextran)T70(40 μg/mL),分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,各以去离子水补至2.0 mL。再加入6%苯酚1.0 mL以及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀,室温放置10 min后,测吸光值(A490),绘制标准曲线。同时将试验所获粗多糖以去离子水定容至100 mL,取样品1 mL,苯酚-硫酸法检测A490,同时对照标准曲线计算多糖含量。
  2  结果
  2.1  多糖性质测定
  在以往对多糖提取方法的优化研究中,通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣,如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为2.58%。该衡量标准较直观快捷,但因粗多糖中仍存在一定杂质,故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量,从糖得率上看数值较低,但结果更为精确。羊肚菌多糖溶于水,不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色,说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性,说明不含单糖和多酚类物质;Molish反应为阳性,说明是典型的糖类物质;CTAB反应和硫酸-咔唑反应阳性,说明含有糖醛酸。对羊肚菌多糖在190~390 nm扫描发现,其对核酸(260 nm)和蛋白质(280 nm)无明显吸收峰[7],可知该多糖样品中不含游离核酸及蛋白等杂质。试验结果表明,超声和酶法处理均可显着提高多糖得率,且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下,恒温加热150 min,浸提2次,多糖的得率最高。两种菌种之中,以GIM5.69型菌种多糖得率较高。
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