1 材料及方法

  1.1 实验材料

  1.1.1 动物健康Sprague'Dawley(SD)大鼠54只,雌雄不限,清洁级,体重250~300g,由苏州大学医学院实验动物中心提供。随机分为三组:SNP组(S组)、沙利度胺治疗组(T组)、对照组(C组)。

  1.1.2 主要试剂及仪器牛磺胆酸钠(Solarbio公司);TRIZOL(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(日本Takara公司)。

  1.2 方法

  1.2.1 动物模型的建立SD大鼠术前禁食12h,不禁水;2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉后,消毒腹部皮肤,正中切口入腹,从胆胰管开1:3插入套管针,经微量注射泵缓慢匀速(0.1ml/min)注入4%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g);5min后去除动脉夹,关腹。S组和T组动物先制成大鼠SNP模型。

  沙利度胺25g溶于500ml橄榄油中,备用。模型成功后S组不作其他处理;T组建模后1h沙利度胺(200mg/kg)灌胃。C组只开腹翻动胰腺后随即关腹,不作其他处理。术后3h、6h、12h三个时间点处死大鼠,每个时间点6只大鼠。

  1.2.2 检测指标:检测各组血清的TNF ,IL一6,IL一18 分别按时间点各组在相应时间点经心脏穿刺取血处死大鼠,所取新鲜血液经高速低温离心机离心(4cc,3 500r/mi10min分离血清后一20℃冰箱中保存待测。放免法测血清TNF 、IL_6、IL一18(按试剂盒说明进行,试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司)。

  2) 检测外周血CD4+.CD8 的T细胞水平变化:取专用试管3支,各试管加入大鼠外周血标本100txl, 分别ⅡCD3一FITC/ICOS-PE,CD4一FITC/CD8一PE单克隆双色抗体5pJ,然后与之充分混匀,室温避光下孵育15min,然后每管加入10~FACS(细胞裂解液)溶血剂2ml,充分混匀,室温避光下溶血10 min至完全透明,1500r/rain离心10rain,弃上清液,PBS洗涤3次,每管加入0.5 mlPBS液悬浮,混匀放置室温下待测。用美国Beck.man公司生产的流式细胞仪测定。

  3)腹水量的检测 开腹观察腹水性质及量(用无菌纱布塞人大鼠腹腔约5min,比较前后的重量,大体估算出腹水量)。

  4)胰腺组织中TNF一仪mRNA的表达用半定量RTPCR检测TNF一仪mRNA表达。取液氮冻存胰腺组织,用Trizol试剂一步法抽提胰腺样品总RNA,通过读取其在分光光度计A抛~Az m处的吸收值,测定RNA浓度和纯度。随机引物法将.RNA逆转录为cDNA,再以TNF一 引物进行PCR扩增,pactin作为内参照。TNF一仅引物上游序列为:5-CCAACAAGGAGGAGGAGAAGT一3,下游序列为:5GTATGAAGTGGCAAATCG一3,扩增片段323bp;pactin 上游序列为:5一CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC~3,下游序列为:5一TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT一3,引物扩增片段241bp。PCR条件为:退火温度54℃及循环数38。

  5)胰腺组织的病理变化观察胰腺组织大体病理变化后,取部分十二指肠区胰腺组织常规固定,HE染色。光镜下按Schmidt等描述的组织学病理分级法,由两位病理科医师用盲法评分。

  6)胰腺组织ICAM一1免疫组化染色 结果判定:以细胞膜或胞浆内呈现棕黄色颗粒者为阳性,随机观察5个具有代表性的高倍视野,并根据阳性细胞占总细胞数的比例记0~4分:阳性细胞数<5%记0分,阳性细胞数5%~25%记1分,阳性细胞数26%-50%记2分,阳性细胞数51%~75%记3分,阳性细胞数>75%记4分。

  2 结果

  2.1 血清的TNF一仅、IL一6、IL一18的变化在3、6、12h S组的IL一6水平较C组明显增高(P<0.05),在6、12h T组的IL一6水平较S组明显降低(P<0.05),在3、6、12h S组的IL一18水平均较C组明显增高(P<0.05),在12h T组的ILl8水平较S组显着降低(P<O.05)。在3、6、12h S组的血清TNF一水平均较C组明显增高(P<0.05),T组较S组显着降低(P<O.05)。

  2.2 外周血CD4+,CD8 的T细胞水平变化S组和C组相比,CD4细胞在3、6h显着增高(P<0.05),12h显着降低,CD8q'细胞在6、12h显着下3 讨论 .SNP发病机制十分复杂,研究表明胰腺腺泡细胞的破坏是胰腺炎发生的起始事件,随之多种酶的级联激活、炎症因子及多种炎性细胞的激活和相互作用引起SIRS,终导致MODS。因此SNP目前仍有20%~30%的死亡率嘲。

  目前认为细胞因子增加在全身并发症发生之前,是促使并发症发生的早期炎症介质,TNF一能作用于多种细胞,在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应。IL-6是炎症反应中的重要介质,参与急性相反应诱导细胞间黏附分子-1(ICAM一1)和血管细胞黏附分子(VCAM)的表达,导致炎症进展,并且可直接作用于血管内皮细胞,使其通透性增加,导致大量炎性渗出,与TNF一 等协同,构成炎症介质网络。急性胰腺炎时单核巨噬细胞可在脂多糖(LPS)、TNF-ot等诱导下产生IL一6,体外CAPAN一1和CAPAN一2细胞株也能对LPS或TNF一仪产生浓度依赖性应答表达IL一6,提示胰腺细胞亦能产生IL一6,主动参与AP发病机制。

  本实验研究发现在SNP建模成功后血清TNF-c~始终保持在较高水平,对胰腺组织TNF一 mRNA检测也证实同样的结果,表现为建模成功后的胰腺组织rINF一 mRNA较对照组表达明显增高。而IL一6检测结果表明在建模后随着时间的推移逐渐升高。以上实验结果表明SNP发生后,TNF一 在机体的炎症反应中处于始动地位,对细胞因子的级联释放具有重要意义,起到;扳机”样作用,促进炎症细胞的迁移,并刺激靶细胞产生IL一6等炎症因子,引起连锁和放大反应,即所谓的;瀑布效应”,进一步出现SIRS,并可进一步发展为MODS。如何调整炎症反应,使炎症因子维持一种低水平的平衡状态,可能是治疗SNP的合理措施。

  Moreirat等在研究中发现。沙利度胺可抑制由LPS诱导的TNF的产生,从而抑制炎症反应,在给大鼠注射致死剂量的LPS前先给予该类似物,可极大地抑制内毒素性休克,并分析这一效果可能是通过使TNF一仅mRNA水平下降,下调TNF-a和一氧化氮的产生而产生的。本实验研究发现模型组和治疗组在建模后3h血清中的TNFOL都出现增高,并且模型组始终保持在高水平状态,而治疗组血清中的TNF一 随着时间的延长逐渐降低,说明沙利度胺具有抑制SNP时TNF表达的作用。本实验发现沙利度胺处理SNP大鼠后在6h和12h时IL一6较模型组明显降低,从另一侧面证实了沙利度胺对SNP的治疗作用。进一步对胰腺组织TNF一 mRNA表达的检测发现,沙利度胺的干预能明显下调胰腺组织TNFmRNA表达,从而缓解胰腺的局部炎症反应。

  IL一18是由库否细胞及活化的巨噬细胞产生,能在内毒素血症时刺激机体产生IFN一,Ueda等研究表明,IL一18在急性胰腺炎并发多脏器功能衰竭患者中显着升高,阻断ILl8是治疗SNP并发多脏器功能衰竭的重要途径。本实验研究发现治疗组IL-18较模型组中降低,其中12h时具有统计学意义等。研究发现,ILl8的表达和ICAM一1的表达具有相关性,并参与了急性胰腺炎并发多脏器功能衰竭。本实验研究表明沙利度胺能抑制SNP中ICAM一1的表达,说明沙利度胺不但能抑制SNP胰腺局部的炎症反应,减轻胰腺的水肿和坏死,还能通过抑制系统炎症反应,减轻多脏器功能衰竭。

  Ueda等研究发现SNP患者入院后14天时的CD4 和CD8叩细胞数量减低和继发感染相关。

  本实验中治疗组12h的CD4 和CD8+1细胞数量均较模型组增高,表明沙利度胺对SNP时的免疫紊乱具有一定的调节作用,从而减少继发感染的发生。综上所述,沙利度胺对大鼠SNP时的炎症反应具有抑制作用,其机制是沙利度胺可能通过抑制TNFd mRNA的表达,减少炎性介质的释放,并通过调节免疫紊乱,减轻SNP的病理损害。