脑出血(ICH)是一种源于脑实质内血管的急性、自发性出血,调查显示ICH的发病率、死亡率呈逐年上升趋势,发病初始年龄年轻化,具有死亡率高、致残率高、并发症多等特点 。

  脑出血所导致的神经功能的损伤不仅由于血肿的占位效应及血肿对周围组织的直接破坏,脑出血后继发性的脑水肿更是导致继发性神经元损害的主要原因 。基质金属蛋白酶(MMPs)的病理作用是破坏细胞外基质(ECM),在有血脑屏障破坏的神经系统疾病中MMPs表达明显升高 。其中MMP一9是与脑内血管壁破坏和出血关系密切的一种~IMPs ]。本研究观察电针在治疗急性脑出血时对lVIblPs的动态影响,分析电针治疗脑出血的部分作用机制。

  1 材料与方法

  1.1 动物、仪器及主要试剂选取清洁级健康成年雄性Wistar大鼠120只(湖北省疾病控制中心提供),体重200g左右。SR一6N型脑立体定位仪(日本产);SD一101型脑立体定位钻(日本产);电子天平秤、红外线干燥仪、石蜡切片机、微量进样器(上海高鸽工贸有限公司);Olympus光学显微镜、数码照相机(日本产),华佗牌3O号0.5寸不锈钢毫毫针(苏州产)。胶原酶Ⅲ(美国Sigma公司)。

  1.2 造模方法将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,其中模型组、电针组又分为6、24、48、72h 4个时相组,一共是lO组,每组12只。采用胶原酶Ⅶ诱发大鼠尾壳核脑出血模型。脑出血模型制作参照Rosenberg和Nun的方法建立脑出血大鼠模型。Ⅶ胶原酶的用量是0.5u,假手术组用生理盐水代替Ⅶ胶原酶。模型组和电针组均有神经功能缺损的表现,术后34 h均出现明显肢体偏瘫,表现为行走时有不同程度的旋转、前肢内收、后肢外展,且在取脑组织时可见脑内血肿形成。模型制备成功才能用于实验,正常组和假手术组大鼠未出现神经功能缺损症状。

  1.3 治疗方法电针组选用3O号0.5寸不锈钢毫针,分别于造模后3、24、48、72 h时开始针刺百会、水沟和足三里,针刺深度参照《常用动物动物腧穴图谱》标准。接G68052型电针治疗仪,水沟和右侧大鼠耳朵接一对电极,百会和足三里接一对电极,连续波,频率2赫兹,强度lmA,每次留针30rain,每Et针刺1次,共5d。

  正常组、模型组、假手术组同等条件饲养,不进行任何治疗。

  1.4 取材和检测以上各组中取6只大鼠在相应时间点断头处死,小心剥离颅骨,在冰盘上迅速取出完整取脑组织,于4't2预冷的生理盐水中,洗去余血,置一70~C保存待测。

  1.4.1 脑组织含水量的测定:取血肿边缘脑组织300rag左右。利用电子天平称取每块组织湿重后,在IO0~C红外线干燥箱中烘干24 h,称取干重,脑含水量计算公式为:脑组织含水量=(湿重一干重)/湿重×100% 。

  1.4.2 Western-blot检测血肿周围组织MMP-9的表达:去除嗅球及额极前部4 lrlm的脑组织,取血肿周围组织约200rag,常规匀浆分离后,取上清液,电泳、转膜、封闭、免疫印迹、检测、显色曝光、分析灰度值。

  1.5 统计学方法实验数据用(元±s)表示,使用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析,P<O.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 各组脑出血大鼠脑组织含水量的动态变化模型组24 h内出血侧脑含水量明显增高,72 h达到高峰,在2472 h维持较高水平后下降,与正常组比较有显著性差异(P<O.01);与模型组比较,电针组6h无明显差异,其余各相应时间点的电针组与模型组比较有统计学意义的差异(P<O.05)。

  2.2 各组脑出血大鼠MMP一9的动态变化模型组MMP一9的表达在6h开始增强,在24h的表达增强非常显著,在48h达到高峰,在72h表达略有下降;各相应时间点的电针组与模型组比较,MMP一9的表达均明显减少,有显著的统计学意义(尸<0.01)。各电针组组间比较,24h组表达显著低于其他组别。

  3 讨论

  炎性反应参与了脑出血后继发性损伤,促使中性粒细胞向血肿周围脑组织转移,释放或诱导自由基、兴奋性氨基酸、蛋白酶细胞因子等多种细胞毒性物质的释放,对局部的脑组织造成损伤和引起脑水肿的加重。lVIMP一9是一种蛋白水解酶,破坏血脑屏障,是脑出血后脑水肿发生的重要因素之一。大量的研究表明,脑出血后MMP一9的表达明显增强,本实验也表明脑出血后6 h l~IkIP一9表达开始上升,2448 h达高峰,以后逐渐下降,与研究结果一致。

  脑出血相当于中医中风病的范畴,早在《内经》中就有记载:;阳气者大怒则形绝,而血菀于上,使人薄厥”。中风病病位在脑,本实验选取百会、水沟、足三里穴,百会可以调节全身各经脉之经气,使气血流畅,上行荣与脑,使脑髓充盛,并能开窍宁神,活血化瘀,熄风通络,升阳固脱,水沟穴是督脉、手阳明、足阳明经之会,是醒神急救之要穴。从现代神经解剖学和生理学来看,水沟穴位于三叉神经的上颌支眶下神经及颈交感神经支配区,可调节脑血管功能。本实验表明脑出血后,早期选取以上穴位进行电针治疗,能够明显减少MMP一9的表达,从而减轻血脑屏障的通透性,减少脑组织的含水量。然而针灸治疗具有多靶点、多途径、多环节的作用特点,具体电针是如何减缓其炎性反应过程,是否还通过其他途径来减轻脑组织水肿程度,尚需进一步的研究。

  另外,关于针灸治疗脑出血的时间问题一直以来都有很大的争议,认为急性期用电针治疗不会有很好的疗效,我们也在早期的试验中发现脑出血后3h就进行针灸治疗会加重病情。本研究设立了6h组,发现脑出血后6h就进行针灸治疗对MMP一9的表达没有明显的作用,而2472h后进行电针治疗显示:

  血肿周围MMP一9的表达显著性的减少,在脑出血急性期进行电针对减轻脑水肿有很好的作用,而在脑出血24h后进行电针治疗对MMP一9的影响明显。当然本实验没有足够的数据显示在脑出血后24h进行电针治疗对减少脑水肿为有效,今后将会进一步通过实验研究来证明某一时间点进行针灸治疗脑出血为有效。