本文是一篇专业的医学论文,主要阐述了姜黄素对中波紫外线照射HaCaT细胞凋亡的影响的相关情况,详情请看下面的介绍

  姜黄素是一种从姜黄中提取的物质,是姜黄的有效成分。姜黄素已在食用辅料和疾病治疗中有应用,其具有抗炎抗氧化、抑制多种肿瘤生长等作用,有良好的应用前景[1-3]。近年来,与姜黄素相关的研究及应用大多集中在姜黄素的抗肿瘤细胞作用上[4],但姜黄素对UVB照射的角质形成细胞的作用,国内目前很少有报道。本文通过实验研究,发现了姜黄素在UVB照射HaCaT细胞时,能够促进其凋亡,并分析了其可能的作用机制。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  人角质形成细胞株(HaCaT细胞)购于百奥迈科生物技术有限公司;姜黄素(Sigma公司);完全培养基由细胞培养基(DMEM)(Gibco公司)、10%小牛血清(四季青公司)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素组成;四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司),乙二胺四乙酸钠(EDTA,上海生工生物工程公司),噻唑蓝(MTT),二甲基亚砜(DMSO,天津市天河化学试剂公司),caspase-3及caspase-9检测试剂盒(碧云天生物技术研究所),Annexin V-FITC试剂盒(深圳晶美生物有限公司);UVB紫外照射仪(北京大学光电仪器厂),超净台、孵育箱(美国Sheldon公司),倒置相差显微镜(上海长方厂),DG-3022A型ELISA检测仪(南京华东电子管厂),流式细胞计数仪(美国Becton Dickinson公司)。

  1.2 方法

  1.2.1 药物配制 用少量无水乙醇溶解姜黄素粉(Sigma公司),配制成5×103 μmol/L浓度的溶液,于-20℃保存。使用时,用培养液稀释,使终的无水乙醇浓度< 0.1%。

  1.2.2 HaCaT细胞的传代培养及种板 人角质形成细胞株HaCaT细胞用完全DMEM培养液(含10%胎牛血清),置于37.0℃、5%CO2孵育箱中培养,定时更新培养液。估计细胞单层铺满容器底时,PBS洗涤1次,先后加入0.02%EDTA溶液1 mL,0.25%胰蛋白酶溶液1 mL。将培养液放入孵育箱内消化5 min后,在倒置相差显微镜下时,可观察到细胞体外形变圆。当观察到大部分细胞变圆时,加入培养液,终止消化过程。用吸管沿容器壁吹,使贴壁细胞尽可能多地脱离容器壁。置于离心机中,1 000 r/min离心5 min,吸弃上清,再用PBS洗涤1次。加入适量的完全培养液,吸管吹打均匀后,转入培养瓶中继续培养。将培养后的细胞配成单细胞悬液,使用细胞计数板计数后,用培养液将其单细胞悬液稀释10万倍后,接种于培养板,于孵育箱内培养至80%融合度,留存,用于试验。

  1.2.3 药物处理及UVB照射细胞 向以上培养板中分别加入浓度0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L的姜黄素,不同浓度分别设定8个复孔。对培养板中的细胞预处理60 min后,吸弃培养液,并加入少量PBS,后以剂量30 mJ/cm2 UVB照射细胞,更换完全培养液后,继续培养24 h或18 h后,进行以下实验。

  1.2.4 检测细胞内的caspase-3及caspase-9活性 细胞继续培养18 h后,吸取部分培养液,使用胰酶消化贴壁细胞,转至新的培养液中。低速4℃离心5 min,去上清。PBS洗涤后,加入裂解液(每200万个细胞加入100 μL裂解液),轻摇匀使其重悬浮,置冰浴反应15 min。之后放入离心机,4℃ 16 000 r/min离心15 min,取上清至离心管,按说明书加入试剂后混匀,培养约2 h,自培养1 h起开始逐渐缩短时间间隔,观察颜色变化,有明显变化时开始测定样品吸光度。所得数据与空白对照品数据的差,即为样品中的caspase-3和caspase-9催化底物对应产生的吸光度。

  1.2.5 检测细胞的增殖情况 继续培养24 h后,加入MTT 10 μL,培养4 h。吸弃培养液,逐孔加入DMSO 100 μL,震荡10 min使其充分反应,测定吸光度(λ=490 nm),实验3次。

  1.2.6 观察HaCaT细胞的凋亡情况 细胞继续培养24 h后,收集细胞。用PBS(预冷)洗涤2次后,用250 μL缓冲液使其重悬浮,调节浓度至1×106个/mL。取悬液100 μL于5 mL流式管中,加入Annexin V-FITC 5 μL和浓度20 μg/mL碘化丙啶溶液10 μL,混匀,孵育15 min(室温,避光)。之后,在反应管中加入PBS 400 μL,后用流式细胞仪进行分析。

  1.3 统计学方法

  应用SPSS 13.0统计软件,建立数据文件。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,对各组数据行单因素方差分析,对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析,两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 姜黄素对UVB照射HaCaT细胞增殖的影响

  HaCaT细胞经强度30 mJ/cm2 UVB的照射后,其OD值明显低于正常组(未照射)细胞(P < 0.05),说明UVB明显抑制了HaCaT细胞的增殖。对姜黄素预处理过的HaCaT细胞进行UVB照射,测得的OD值低于对照组(P < 0.05)。另外,实验还发现,OD值的降低与姜黄素呈浓度依赖性。因此,姜黄素对UVB诱导的角质形成细胞的增殖抑制显示出明显的协同作用。各组细胞的OD值见表1。

  2.2 姜黄素对UVB照射HaCaT细胞形态变化的影响

  正常组HaCaT细胞在倒置显微镜下形态一致,边界清楚,排列紧密,但UVB照射组及不同浓度的姜黄素联合UVB照射组,单位面积HaCaT细胞数量明显减少,体积变小,间隙增大,贴壁性降低,细胞膜皱缩,细胞核固缩,可见部分细胞裂解成为碎片,并有大量漂浮的细胞,其中2.50、10.00 μmol/L作用下的细胞形态学变化明显。各组细胞形态学的变化见图1。

  2.3 姜黄素对UVB照射HaCaT细胞凋亡率的影响

  结果显示,正常HaCaT细胞亦存在凋亡,但其凋亡率低,为4.6%,UVB照射后,HaCaT细胞的凋亡率显着提高。HaCaT细胞先用姜黄素处理,再照射UVB,细胞凋亡率比单用UVB照射高,说明姜黄素对UVB照射HaCaT细胞凋亡有明显的诱导作用,实验所得细胞凋亡率,见表2。

  2.4 姜黄素对UVB照射HaCaT细胞内caspase-3、caspase-9活性的影响

  caspase在细胞的凋亡中起着极其重要的作用,为了研究姜黄素诱导UVB引起的细胞凋亡的机制,本实验检测了caspase-3及caspase-9的活性,结果发现,紫外线照射后,OD值与正常组比较明显升高(P < 0.05),两种酶的活性增加。姜黄素预处理后行照射UVB,细胞内caspase-3及caspase-9的OD值比单独照射UVB组明显升高(P < 0.05),因此,caspase-3及caspase-9的活性增加更为明显。见表3。

  3 讨论

  自20世纪80年代以来国内外对姜黄素进行了食品和药物相关的大量研究,发现了姜黄素的多种生物活性,用实验探索了许多用途,如抑制多种肿瘤生长等,姜黄素材料来源广,成本低,毒性低,安全性高,在治疗多个系统的疾病中展示了良好的应用前景[5-6],姜黄素治疗及预防皮肤肿瘤的作用使其在皮肤科的应用备受关注。皮肤被覆全身体表,长期处于日光线照射下,UVB为其中对皮肤影响重要的紫外线。姜黄素对处于紫外线照射下皮肤的影响仍无相关报道,因此,本实验选择了表皮细胞系HaCaT细胞,初步研究了姜黄素对UVB照射表皮细胞的影响。而本实验首先发现UVB照射HaCaT细胞后,其增殖受到抑制,可通过流式细胞仪观察到细胞的早期凋亡,应用了分光光度法定量地反映出细胞内csapase-9和caspase-3的活性增加,与以往的报道一致[7]。因此,UVB可通过csapase-9和caspase-3途径诱导并促进角质形成细胞的凋亡。

  相比无光照,姜黄素在光照条件下诱导胃腺癌细胞发生凋亡的作用更显着,有明显的光化学反应特性,有作为光动力学新型光敏剂的开发价值[8],治疗多种增殖性皮肤病,如银屑病[9-10];也同时能反映出姜黄素具有显着诱导细胞凋亡的作用。本实验应用HaCaT细胞研究了姜黄素对UVB照射角质形成细胞的影响,实验结果显示,用低浓度(1.25 μmol/L~10.00 μmol/L)姜黄素就可以显着增加UVB对HaCaT细胞增殖的抑制作用,通过倒置显微镜可观察到细胞变圆,有大量的漂浮细胞。Annexin V-FITC结合流式细胞仪可以观察到细胞的早期凋亡,细胞的凋亡率由4.6%大可以上升至38.42%,同此前的报道一致[11],因此,姜黄素处理过的角质形成细胞再经UVB照射时凋亡率明显增加。

  caspase-9和caspase3是细胞凋亡与裂解[12]过程中的关键物质,目前,有研究姜黄素诱导细胞凋亡的实验,多是采用非光照条件的方法。本实验发现,UVB照射经姜黄素处理的HaCaT细胞会引起其细胞内caspase-9和caspase-3活性的明显增加,反映出姜黄素在光照条件下能诱导细胞凋亡,Balasubramanan等[13]报道检测到了姜黄素通过AP1途径诱导角质形成细胞的凋亡。国外报道,姜黄素在光照条件下可发生光化学反应同时产生细胞毒作用[14-15]。因此,姜黄素作为光敏剂的前景和明确作用机制尚需要研究。