血管内皮细胞为血管壁与血液直接接触的单层细胞，合成和释放多种血管活性物质，参与血管活动的局部调节，在维持和调节心血管生理反应中发挥重要作用。内皮细胞激活或损伤产生机能障碍表现为血管收缩、血压增高、血栓形成、动脉粥样硬化及管腔狭窄、闭塞等。研究表明，在多种心血管疾病中都伴随着内皮功能的障碍。因此血管内皮细胞体外培养已成为近年来研究心血管发病机制的一个重要的手段。本文根据Jaffe等人 诸多研究血管内皮细胞的培养经验，建立并改进了一套操作性强、成功率高、细胞获得多的人脐静脉内皮细胞分离、培养方法。

　　1 材料与方法

　　1．1 材料与仪器DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(德国TryPin)；超净工作台(苏州苏净公司)、CO 培养箱(美国Thermo)、倒置显微镜(日本Olympus公司)。脐带来源于皖南医学院附属弋矶山医院健康产妇足月妊娠剖腹产或分娩后的新生儿脐带。

　　1．2 方法

　　1．2．1 取材由本院产科提供脐带，来自健康产妇足月剖腹产或顺产，无菌条件下剪断脐带，长度>20cm。在手术室无菌条件下挤出脐带内外血液，无菌生理盐水冲洗脐带外血迹，放人灭菌的PBS液中带回实验室。在超净工作台上剪去有钳子夹痕、凝血块段后，找到脐静脉管腔，一端插上三通管结扎固定，打开三通管接50 ml注射器，用37qC PBS液冲洗除净脐静脉内的残血后，另一端用血管钳夹闭，向脐静脉内灌注0．1％ I型胶原酶81O ml充盈管腔，夹闭三通管放入已灭菌的平面皿中。37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液均匀接触血管内皮细胞。收集消化液和两倍消化液的PBS冲洗液，离心1 000 r／min，10 min，弃上清，加入完全培养基重悬。

　　1．2．2 原代培养将收集到的细胞混悬液在血细胞计数板计数后，以1×10 ／ml接种至25 cm 细胞培养瓶，置于5％ CO：、37℃、饱和湿度孵箱中培养；每天倒置显微镜下观察细胞生长情况，观察培养基颜色变化，每2～3天换液1次。

　　1．2．3 传代培养用胰蛋白酶．EDTA消化法。待细胞融合成单层后弃去培养瓶中的培养液，用37℃2PBS液洗涤2遍，加入0．125％ 胰酶．()．01％EDTA1 ml消化，倒置显微镜下见细胞皱缩变圆后，弃消化液，加完全培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液，按1：2比例将细胞悬液接种于培养瓶中。约3 d长满单层，用同法继续传代培养。

　　1．2．4 血管内皮细胞的鉴定①倒置显微镜观察细胞的形态特点。②Ⅷ相关抗原检测：4％多聚甲醛固定内皮细胞，滴加0．5％ 过氧化氢溶液室温孵育；用PBS冲洗，滴加兔抗人Ⅷ一抗工作液，4℃过夜；次日滴加生物素标记的二抗工作液，37oC孵育30min，PBS冲洗，DBA工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后终止显色，进行封片。

　　2 结果

　　2．1 内皮细胞体外生长情况 用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞，4 h后大部分细胞贴壁，4872h生长快，相差显微镜下观察可见，早期细胞呈小多角、球形、团状，逐渐生长成梭形、单层，呈铺路石状排列。胞浆丰富，核清晰，呈圆形或椭圆形，偶见双核。传代细胞较原代细胞生长旺盛，可见双核和核分裂细胞，有时可见多核及巨细胞。

　　2．2 血管内皮细胞鉴定人脐静脉内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学染色法可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆丰富，与阴性对照相比，阳性结果表现为细胞胞浆的棕黄色染色颗粒，即为阳性反应，证实培养的细胞为内皮细胞。

　　3 讨论由于内皮细胞株的缺乏，通过原代分离和培养人脐静脉血管内皮细胞是常见的方法。以人脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源，是因为它具有取材、操作方便，获得细胞数多，而且还具有与动脉生物学特征相似的优点。

　　HUVECs(human unbilical vein endothelial cells)原代分离培养目前主要是酶消化法。酶消化法中常用的酶有胶原酶和胰蛋白酶等。胶原酶具有对细胞毒性小，能获取较多细胞等优点，是比较理想的消化酶。胰蛋白酶虽然也能获取较多的细胞，但较胶原酶对细胞的毒性大。选用0．1％ 胶原酶，置于预热的37℃ 水浴箱5～8 min，作用12 min，消化时温度越接近37℃，时间就越短。HUVEC体外生长适应能力较差，在培养上有一定难度。我们在借鉴前人技术的基础上采用了胶原酶灌注法体外培养内皮细胞，得出如下体会：①脐带应新鲜，长度>20cm，严格无菌操作。②仅需剪去脐带一端而非两端，这样既尽可能保留脐带长度又省事，非操作端只要夹闭即不再动，而操作端在三通管接头部操作而不与脐带接触。③灌注消化酶时脐带弯曲成u形，消化酶充盈脐带排空空气后再夹闭另一端。④连接三通管的注射器禁止拔出，一同进入培养箱，可减少污染。⑤注射器回抽消化下的内皮细胞并直接注入离心管，决非先倒人平皿中再用吸管吸至离心管。

　　本实验采用酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞并进行体外传代培养。通过内皮细胞标志物Ⅷ 因子免疫组织化学染色法鉴定符合血管内皮细胞性质，不仅说明本实验所用方法成熟、可靠，而且为进一步研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系，提供了一种有用的实验方法。