返魂草胶囊是由《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第4册所载返魂草冲剂改剂而来。由冲剂改剂为胶囊剂，药物剂型外观整洁大方，服用方便，掩盖了药物的不良气味，服用后能迅速崩解释放药物而发挥疗效。返魂草胶囊由返魂草单味药组成具有清热祛痰，镇咳平喘之功效。用于肺内感染，慢性支气管炎，喘息性支气管炎，急性呼吸道感染等。
在返魂草冲剂的质量标准中无含量测定项，为了完善返魂草胶囊的质量标准和控制药品质量，新增以绿原酸为测定指标的含量测定项。返魂草主要活性成分为酚酸类化合物，包括绿原酸、咖啡酸、对一羟基苯乙酸等。而其中的绿原酸(Cyclohexanecarboxy1icacid，C16Hl8O9)具有较强的抗病毒作用，是制剂发挥疗效的主活性成分，选择绿原酸作为含量测定指标，可反映和控制本制剂的质量。本文参照《中华人民共和国药典2010年版一部金银花下绿原酸的含量测定方法和文献，采用高效液相色谱法对本品中绿原酸的含量进行测定。
1 仪器与试药
1．1 仪器：高效液相色谱仪：SPI)_1OAVP紫外检测器、LC一10AT高压泵(日本岛津)紫外可见分光光度计(UV-2550日本岛津)，电子天平(BP211D赛多利斯)。
1．2 试药：试剂：乙腈(色谱纯)，水为高纯水；其它试剂均为分析纯。对照品：绿原酸(由中国药品生物制品检定所提供110753200613)。药品：返魂草胶囊(自制)；阴性对照品。
2 实验方法与结果
2．1 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：AgilentZorbaxSC185m(4．6×250mm，Agilent)，流动相：甲醇一2醋酸(25：75)，检测波长：327nm，流速：1．0mL／min，柱温：30℃，理论塔板数：以绿原酸峰计算不得低于3000。
2．2 对照品、供试品溶液的制备：对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品约10mg，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成约400mg／L的溶液，密封避光储存于一2O℃。供试品溶液的制备：取装量差异检查项下的供试品颗粒，研成细粉，精密称取0．7g，置于5OmL量瓶中，加5O甲醇至刻度，密塞，精密称定，浸泡1h，超声提取20rain(200W，40KHz)，密塞，放冷，精密称定，补足失重，摇匀，滤过，作为供试品溶液。阴性对照品的制备：取处方项下所用辅料，按O5版中国药典胶囊剂剂型制作方法及2005版中国药典含量测定方法测定项下供试品溶液制备方法制备模拟阴性对照品溶液。
2．3 测定及结果：分别精密吸取对照品溶液、阴性对照液与供试品溶液各1OL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品溶液色谱中，在与绿原酸对照品溶液色谱峰相应位置上有相应峰，而阴性对照溶液色谱中无此峰，说明在本色谱条件下，绿原酸出峰时段无干扰，分析条件专属性良好。
2．4 线性关系考察：精密吸取绿原酸对照品溶液(约400mg／L)5mL，置于50mL量瓶中，加5O%甲醇至刻度，配成约40mg／L的溶液，依次取1，2，3，4，5，6，7，8，9mL置于1OmL量瓶中，加5O甲醇至刻度，依次配制成约4，8，12，16，2O，24，28，32，36mg／L对照品溶液。摇匀，滤过，分别精密吸取1OL注入液相色谱仪，记录色谱图；以进样量(g)为纵坐标，绿原酸峰面积(mAU／s)为横坐标，进行线性回归，得线性相关系数及工作曲线方程式，结果见表1。结果显示，绿原酸在进样量0．0400～0．3202g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2．5精密度试验：取绿原酸对照品储备液适量，加甲醇制成约20mg／L的溶液，取1OL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，以绿原酸峰面积(mAU／s)计算RSD(Vo)。结果显示RSD为0．23%，方法精密度良好。
2．6重现性试验：按2005版中国药典含量测定方法测定项下，取同一批样品平行制备6份供试液，精密吸取l0L注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积代人工作曲线求得绿原酸含量，并计算RSD，测定结果.结果显示，方法重现性较好.
2．7稳定性试验：按2005版中国药典含量测定方法测定项下，制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h精密吸取10L注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，由峰面积变化观察供试品溶液在该时段的稳定性。结果显示，供试液在8h内稳定。
2．8 回收率试验：采用加样回收法。取适量绿原酸对照品，精密称定，配成约400mg／L的甲醇溶液。精密称定已测定含量的样品细粉适量，置于50mL量瓶中，精确加入约400g／mL绿原酸甲醇溶液1．5mL，补加5O甲醇至刻度，按供试品溶液的制备项下制备供试液，精密吸取10L注入液相色谱仪中，记录色谱图及峰面积，计算回收率，结果见表5。
实际样品取样量及相应峰面积见表6。表5结果显示，本试验回收率较高。
2．9 样品的含量测定：按外标法进行测定。对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精确称定，加入甲醇溶解制成约20mg／I的溶液即得。供试品溶液的制备：1O粒供试品内容物，混匀，研成细粉，精密称取0．7g左右，置于50mL量瓶中，加5O甲醇至刻度，密塞，精密称定，浸泡1h，超声提取20min(200W，40KHz)，密塞，放冷，精密称定，补足失重，摇匀，滤过，即得。测定法：精密吸取供试品溶液各1OL，注人液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，按外标法计算绿原酸含量，即得(绿原酸对照品浓度：20．0105mg／L，峰面积580．3mAU／s)。3批样品测得绿原酸含量在474．1～475．9g／粒，线性方程计算结果为480．5~482．4g／粒。两种计算方法所得结果基本一致，且含量结果均符合含量限度要求。
3 讨论
3．1 测定方法的选择：文献报道绿原酸的含量测定法有单扫描极谱法、毛细管区带电泳法、薄层扫描法、薄层色谱法、液相色谱法等，其中以高效液相色谱法的应用为广泛且效果好，故本实验选择高效液相色谱法进行含量测定。
3．2测定波长的选择：用高效液相色谱法测定绿原酸含量时，常用的检测波长为327rim。经试验取绿原酸对照品溶液，照紫外分光光度法，在200～400rim波长范围内测定吸光度，绘制吸收曲线，对照品溶液在327rim处有大吸收。因此，采用327nm作为测定波长。
3．3 流动相的选择：关于使用十八烷基硅烷键合硅胶柱测定中药复方制剂中绿原酸的流动相，依据药典和相关文献主要有：甲醇：0．4%磷酸溶液(20：80)、乙腈一水一磷酸(10：90：0．2)、乙腈：2%醋酸(13：87)、乙睛：0．4%磷酸溶液(9：91)，经试验采用甲醇：2%醋酸(25：75)系统作为流动相，具有分离效果好、无杂质峰干扰、峰形较对称等优点，理论塔板数可达3000以上，且易于操作、经济，故选择该流动相系统。
3．4提取溶剂的选择：比较以甲醇、50%甲醇、20%甲醇和乙醇为提取溶液对样品进行处理，结果以50%甲醇提取物杂质量少，重复性好，故选择5O%甲醇为提取溶剂。
3．5 超声处理时间的选择：超声时间的影响：取3粒供试品内容物，混匀，研成细粉，精密称重为1．9914g，将细粉平均分成3份精密称重为0．6638g，分别将20，30,40min超声提取的溶液注入液相色谱仪，测得的峰面积(mAU／s)分别为571．0、598．2、598．1，可见20～40min超声提取效率基本一致，故供试品溶液制备采用超声20min。
3．6返魂草胶囊中绿原酸含量限度的初步确定：本品的含量测定为新增项目，3批样品经测定绿原酸的含量，结果分别为481．3，480．5，482．4g／粒。考虑到大生产时损耗可能会大一些，以及受药材含量高低的影响，绿原酸的含量会有所波动，建议本品绿原酸的含量暂定为不少于300sg／粒。
本实验对返魂草胶囊中绿原酸的含量测定进行了较全面、系统的研究，确定了测定返魂草胶囊中绿原酸含量佳的流动相和检测波长，优选了供试品溶液制备时提取溶剂和超声处理的佳时间，同时我们进行了线性关系考察，精密度试验，重现性试验，方法稳定性试验，回收率试验，结果表明本实验方法专属性强，线性关系、精密度、重现性、方法稳定性、回收率良好。
