DNMT1是DNA甲基转移酶(DNMTs)中为重要的一个成员，起着维持甲基化的作用，DNMT3b基因主要功能是参与从头甲基化。研究发现，DNMT1和DNM]3b在多种肿瘤中的表达是明显上调的，可能通过抑癌基因启动子高甲基化和促使突变的不同机制参与肿瘤的发生，且其活性升高是肿瘤细胞的一个特征性的早期分子改变。为研究DNMT1和DNMT3b在DNA甲基化及膀胱癌发生、发展中的作用，并为之提供实验工具。本实验构建了DNMT1小分子干扰RNA(siRNA)重组质粒和DNM1r3bsiRNA重组质粒，并进行了鉴定。

　　1资料与方法

　　1．1实验材料pGPU6／GFP／Neo载体由上海吉码制药技术有限公司提供。DH5a菌由本实验室保存。质粒抽提试剂盒(OMEGA公司)，LB细菌培养基、0．1mol／LCaC1、卡那霉素由本实验室提供。

　　1．2实验方法

　　1．2．1DNMT1、DNMT3b的发卡寡核苷酸的设计根据GenBank中报道的DNMT3B和DNMT1的核甘酸序列(No．001379和No．006892)，参考siRNA设计策略，分别设计四对短发夹RNA(shRNA)，经BLAST筛选，排除DNMT1、DNMT3b以外的同源性序列，同时设计阴性对照序列，该序列不与任何基因具有同源性。shRNA模板中的loop结构选用了TYCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5端添加了GATC，与PstI酶切后形成的粘端互补；如果shRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。设计10对寡核苷酸序列。

　　1．2．2shRNA模板的退火将DNAoligo分别用TE(pH8．O)溶解，浓度为100txmol／L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，退火反应体系：10×shDNAAnnealingBuffer5，正、反义链各5l，重蒸水(ddHO)35l。按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70°C5min：4℃保存。退火处理后得到浓度为10ixmol／L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20nmol／L，用于连接反应。

　　1．2．3pGPU6／GFP／Neo载体的线性化质粒pGPU6／GFP／Neo的BamHI+BbsI双酶切，1％琼脂糖凝胶回收大片段。电泳检测估算浓度，稀释浓度至50L。

　　1．2．4pGPU6／GFP／Neo-shRNA载体的构建按照如下体系进行载体的连接反应：T4连接酶连接退火寡核苷酸链与线性化质粒pGPU6／GFP／Neo(BbsI+BamHI)，建立20l连接反应体系：取稀释退火寡核苷酸链1l，线性化pGPU6／GFP／Neo(BbsI+BamHI)质粒载体1Ixl，10×LigaseBuffer2Ixl，T4连接酶0．5l，H2O11．5l，22℃水浴反应过夜。每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50mlKanamycin的LB培养集中。

　　1．2．5质粒的转化扩增和提取制备感受态细胞DH5a，每条重组载体分别从培养皿上挑取单菌落接种于落接种LB培养液中，用小提试剂盒小量提取质粒。将所提取质粒直接用于下步实验或一20℃保存。

　　1．2．6重组质粒酶切鉴定使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamHI、分别酶切鉴定。阳性载体应该可以被BamHI切开，而不能被zI切开。取通过酶切筛选鉴定的质粒菌液0．5ml，送上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定。

　　2结果

　　2．1酶切鉴定结果所有质粒均为阳性重组载体

　　2．2测序结果每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定(上海英骏生物技术有限公司)，测序结果与插入的寡核苷酸序列完全相符，表明已经成功构建了针对DNMT1、DNMT3b基因的siRNA表达载体。

　　3讨论
DNAMTs位于细胞核内，DNMT的转录增加和活性增高是肿瘤发生的重要机制之一，也是肿瘤的重要生物学特征之一。

　　研究发现，DNMT家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b4个成员。DNMT1定位于19p13．313．2，由1616个氨基酸组成，蛋白产物的相对分子量是190000。其C端为保守的催化甲基化反应结构域，N端含有一个半胱氨酸富含区，具有结合和调节功能。N端和C端通过一段甘氨酸一赖氨酸重复序列(Gly．Lysrepeats)连接。单独表达DNMT1的N端或C端并不产生催化效应，提示不同的结构域之间存在相互作用。DNMT1具有2个剪接变异体，分别为DNMT1O和DNMTlb。DNMTlo缺乏N端的l14个氨基酸残基，且在体内具有较强的抗分解稳定性一77；DNMT1b是在外显子4和外显子5之问嵌入了一段含有48个氨基酸的序列而形成，其在体细胞中的表达水平仅为DNMT1的2％～5％，但其酶学特性与DNMT1相似，目前对于DNMT1b的生物学功能尚不清楚J。DNMT1是DNA甲基化转移酶中为重要的一员，具有维持甲基化的作用，即根据亲本链上特异的甲基化位点，在DNA半保留复制出的新生链相应的胞嘧啶上进行的甲基化修饰的过程。

　　DNMT3包括DNMT3a和DNMT3b，DNMT3a定位于2p23，编码912个氨基酸的蛋白质；DNMT3b定位于20q。编码853个氨基酸的蛋白质，其C端区域含有5个高度保留的DNAMTs基序，N端含有一个富含半胱氨酸的区域。DNMT3b的功能主要是参与从头甲基化，即在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化的过程。

　　抑制基因表达的方法比较多，RNA干扰技术，尤其是siRNA的诸多研究表明，在哺乳动物细胞中用siRNA能高效阻断某个特定基因的表达。

　　它与正义、反义RNA基因干涉相比，效果强，持续时间长，甚至可持续到下一代；具有基因序列特异性、不受注射部位的影响等优点。本实验采用的siRNA表达质粒载体法尽管操作稍繁琐，构建时间较长，但与其它方法比较，该法在实验中仍然具有较好的优势。首先，质粒构建完成后可长期使用，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久；其次，在质粒法中经常采用的U6启动子在真核细胞中可以精确地起始和终止RNA的转录，并且在细胞体内表达量较为丰富；此外，启动子的转录起始位置刚好被限制性内切酶切断，可直接插入siRNA序列，在转录后不需切除多余的碱基。

　　本实验成功克隆了阻断DNMT1和DNMT3b基因表达的RNAi序列，并克隆至载体GPU6／GFP／Neo中，为以后实验研究打下基础，从而为肿瘤的基因治疗在细胞水平、分子水平、整体水平上提供新的方法。